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UNIVERSIDAD AUTONOMA DE BAJA California Facultad de ingeniería Laboratorio de Bioquímica Práctica 6. Extracción de ADN genómico Profesor: Ing. José Luis Becerra Buenrostro Alumna: Claudia Susana Meza Calvillo Grupo: 291 Mexicali, Baja California; a 19 de abril de 2017.  Marco teórico El Ácido Desox...

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Extracción rudimentaria de ADN. Claudia Meza

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INST IT UT O T ECNOLÓGICO SUPERIOR DE CALKINÍ EN EL ESTADO DE CAMPECHE REPORT E DE … KARIME XIU ORT IZ 1pract ica;ext raccion del ADN de la cebolla y chicharo Vania Cast illo Osornio REPÚBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA MINIST ERIO DEL PODER POPULAR PARA LA EDUCACIÓN Alejandra Gomez

UNIVERSIDAD AUTONOMA DE BAJA California Facultad de ingeniería

Laboratorio de Bioquímica Práctica 6. Extracción de ADN genómico Profesor: Ing. José Luis Becerra Buenrostro

Alumna: Claudia Susana Meza Calvillo

Grupo: 291

Mexicali, Baja California; a 19 de abril de 2017.

 Marco teórico El Ácido Desoxirribonucleico o ADN, es una gran molécula ubicada en todas las células vivas, que posee todos los datos genéticos de un ser vivo y de ciertos virus, considerándose como una acumulación de genes a largo plazo. Este guarda por muchos años los datos genéticos y los transmite de generación en generación, permitiendo el desarrollo de las funciones del organismo, utilizándose estos datos para la producción de proteínas. El ADN posee genes codificados que luego pasan a las moléculas de ARN, las cuales dejan el núcleo y se traducen como proteínas. Se forma con la unión de dos cadenas enrolladas en forma de hélice, que se mantienen de forma paralela, y que poseen a la vez cuatro nucleótidos distintos, que a su vez posee tres unidades: un grupo fosfato, una desoxirribosa, y una molécula de cuarto bases –adenina, timina, guanina y citosina-. De acuerdo a la posición y a la cantidad que tenga cada nucleótido de cada cadena se logrará un cambio en el organismo, es por ello que el ADN siempre es muy variado. El ADN se puede considerar como un almacén cuyo contenido es la información (mensaje) necesaria para construir y sostener el organismo en el que reside, la cual se transmite de generación en generación. El conjunto de información que cumple esta función en un organismo dado se denomina genoma, y el ADN que lo constituye, ADN genómico. El ADN genómico (que se organiza en moléculas de cromatina que a su vez se ensamblan en cromosomas) se encuentra en el núcleo celular de los eucariotas, además

de

pequeñas

cantidades

en

las mitocondrias y cloroplastos.

En procariotas, el ADN se encuentra en un cuerpo de forma irregular denominado nucleoide. Una bacteria Gram positiva posee una pared gruesa de peptidoglicano, mientras que la Gram negativa posee una pared fina de peptidoglicano seguida hacia el exterior por una membrana externa. Esta pared y membrana protegen el interior de la célula, que es donde se encuentra el ADN genómico. Para poder extraer el mismo, debemos utilizar agentes

químicos y/o físicos que debiliten la pared y membrana de la célula. Por ende, es importante conocer el tipo de Gram a la hora de realizar una extracción de ADN genómico, ya que debemos determinar qué agentes utilizar para el rompimiento efectivo de la célula.

La doble hélice de ADN se mantiene estable mediante la formación de puentes de hidrógeno entre las bases asociadas a cada una de las dos hebras. Para la formación de un enlace de hidrógeno una de las bases debe presentar un "donador" de hidrógenos con un átomo de hidrógeno con carga parcial positiva (-NH2 o -NH) y la otra base debe presentar un grupo "aceptor" de hidrógenos con un átomo cargado electronegativamente (C=O ó N). Los puentes de hidrógeno son uniones más débiles que los típicos enlaces químicos covalentes, como los que conectan los átomos en cada hebra de ADN, pero más fuertes que interacciones hidrófobas individuales, enlaces de Van der Waals, etc. Como los puentes de hidrógeno no son enlaces covalentes, pueden romperse y formarse de nuevo de forma relativamente sencilla. Por esta razón, las dos hebras de la doble hélice pueden separarse como una cremallera, bien por fuerza mecánica o por

alta temperatura. La

doble

hélice

se

estabiliza

además

por

el

efecto hidrofóbico y el apilamiento, que no se ven influidos por la secuencia de bases del ADN.

Figura 1. Estructura molecular del ADN.

Las bases nitrogenadas, aunque son de carácter apolar pueden formar puentes de hidrogeno porque poseen átomos altamente electronegativos. En la célula existen algunas enzimas que modifican el ADN. Como ejemplos se pueden mencionar las siguientes: Las nucleasas son enzimas que cortan las hebras del ADN mientras se aumenta la velocidad de la hidrólisis de los enlaces fosfodiéster. Las nucleasas que hidrolizan nucleótidos a partir de los extremos de las hebras de ADN se denominan exonucleasas, mientras que las endonucleasas cortan en el interior de las hebras. Otras enzimas son las ligasas, que son enzimas capaces de catalizar la unión de hebras del ADN rotas o cortadas, en donde se da lugar a un nuevo enlace químico. Las ligasas son sumamente importantes al momento de la duplicación del ADN, ya que unen las hebras del ADN. Extracción de ADN La extracción de ADN se realiza para obtener las moléculas aisladas con alto grado de pureza y poderlas utilizar en investigación científica, en medicina o para la ciencia forense. La mayor parte de los métodos que existen para extraer el ADN consisten en lograr primero la lisis o ruptura de la célula, para luego separar las moléculas de ADN del resto de los constituyentes de la célula. Los pasos necesarios para una correcta extracción y purificación del ADN mediante un procedimiento químico son: 1. Lisis de las células o virus. 2. Degradación de la fracción proteica asociada al ADN. Se consigue mediante la adición de una proteasa. 3. Purificación. Consta de 3 fases, pero, en la práctica solo se llevó cabo la primera, la precipitación del ADN.

Si se opta por realizar el lisado de las células mediante un proceso mecánico hay que tener en cuenta la posibilidad de ruptura de las moléculas de ADN que se intentan extraer, por lo que este debe bastar para lograr la lisis de las células pero no ser muy agresivo para proteger el ADN. Durante la práctica, utilizamos la licuadora para lograr la lisis celular del brócoli, evitando prolongar por mucho tiempo la trituración para no provocar daños en el ADN. El NaCl en disolución actúa disminuyendo la solubilidad de las proteínas, lo que hace que precipiten y se separen más fácilmente del ADN. La acción de la sal es cubrir las terminales fosfatos negativos, permitiendo así que los extremos se unan y el ADN precipite en la solución de alcohol, debido a que el sodio neutraliza la carga negativa de los grupos fosfatos. La adición de un detergente es necesaria a menudo para eliminar las membranas. Los detergentes rompen la barrera lipídica solubilizando las proteínas e interrumpiendo la interacción lípido-lípido, lípido-proteína y proteína-proteína. Los detergentes, al igual que los lípidos, se asocian entre ellos y se unen a superficies hidrofóbicas. Al romperse las membranas celulares se permite la salida del ADN al exterior. El jugo de piña contiene la enzima Bromelina, la cual es una enzima digestiva proteolítica que contiene azufre; la cual digiere proteínas y remueve contaminantes a partir de las preparaciones de ácidos nucleicos. Se emplean para proteger el ADN de la acción de enzimas nucleasas. El ablandador de carne contiene papaína. La papaína es una enzima que se extrae del fruto llamado papaya. Las propiedades peptolíticas de la papaína provocan la ruptura de múltiples enlaces en las proteínas animales. La papaína bruta, contiene un poco de agua, glúcidos, ácidos orgánicos y una mezcla de enzimas, donde destacan las denominadas proteasas que actúan rompiendo los

enlaces peptídicos en cualquier lugar de la cadena peptídica en la que se hallen situados. El ADN es soluble en alcohol, pero se torna insoluble en presencia de sal (NaCl) porque el sodio neutraliza la carga negativa de los grupos fosfatos. El etanol formará una capa en la superficie por ser menos denso que la solución acuosa.

 Competencia Aplicar la metodología de Bioquímica experimental para extraer ADN de muestras biológicas mediante una metodología económica y ecológicamente sustentable.

Material   

Tamiz de malla reducida Tubos de ensaye 2 vasos de precipitados

Equipo 

Licuadora

Reactivos      

Brócoli como material biológico para extracción de ADN Detergente líquido Agua destilada Alcohol etílico NaCl Ablandador de carne o jugo de piña

 Metodología realizada Extracción rudimentaria de ADN 1. En una licuadora se agregaron 25g de brócoli, 3g de NaCl y 50mL de agua helada. 2. Se accionó la licuadora durante 15 segundos a máxima velocidad para romper por daño mecánico el tejido de del brócoli.

Figura 2. Lisis mecánica.

3. Para obtener la parte del brócoli dañado, se pasó la mezcla por un tamiz de malla reducida, colocando un vaso de precipitado debajo de la muestra. 4. A la mezcla en el vaso de precipitado, se añadió 15mL de detergente líquido, se mezcló suavemente, y se dejó reposar por 10 minutos a temperatura ambiente. 5. Se rotularon cuatro tubos de ensaye, para agregar, una vez hecho esto, 7mL de la mezcla con el material genético a cada uno de los tubos. Figura 3. Adición de detergente líquido

6. A cada uno de los tubos se agregó 1mL de jugo de piña. Y a dos de los cuatro tubos se les adicionó unos gránulos de ablandador de carne, y se mezcló. Esto se realizó con el fin de observar la influencia de cada una de las enzimas de ambos productos en la extracción del ADN. 7. Se agregó alcohol etílico deslizándolo por las paredes del tubo, hasta obtener el doble del volumen inicial. 8. Se dejó reposar unos minutos y se observó lo obtenido.

 Resultados Tubo #1

Tubo #2

Tubo #3

Tubo #4

Al tubo #1 le fue De igual manera Al tubo #3 solo se Al agregado ablandador

tubo

que al tubo #1, al le agregó jugo de también de tubo

#2

le

fue piña.

#4 se

Sin añadió

carne y jugo de agregado los dos embargo, el ADN únicamente piña.

El

precipitó

le

el

ADN tipos de enzimas. no precipitó en el jugo de piña. En El ADN precipitó alcohol.

este caso, el ADN

correctamente en correctamente en

si

el alcohol.

alcohol.

el alcohol.

Figura 3. Resultados obtenidos

Figura 4. Tubos en los que el ADN precipitó.

precipitó

en

Figura 5. Comparación entre tubo #1 y tubo #4.

 Discusión de resultados La diferencia entre los tubos a los que se añadió adicionalmente el ablandador de carne y a los que no, es que en los que les fue añadido el ablandador de carne (Tubos #1 y #2) el ADN precipitó más en el alcohol, debido a lo cual se puede decir que, en estos tubos, el peso molecular del ADN extraído es menor que en el tubo #4. Esto puede ser explicado quizá por una mayor cantidad de enzimas actuando contra las nucleasas en los tubos con el ablandador, obteniendo un ADN más puro. En el tubo #3 el ADN no precipitó, posiblemente debido a una mala aplicación de la técnica, al no añadir el alcohol etílico de manera que este resbalara por las paredes del tubo de ensaye, en cambio añadiéndolo de manera descuidada propiciando que este se combinara con el resto de la mezcla.

 Conclusiones Durante la práctica se aprendió una técnica de extracción de ADN de manera rudimentaria. Cada uno de los elementos añadidos durante de la extracción cumplen una función importante para alcanzar el objetivo final. Al licuar el brócoli se realizó lisis celular; se eliminaron las membranas de las células vegetativas al añadir el detergente líquido, y así permitir la liberación del ADN; una vez libre, el NaCl actuó disminuyendo la solubilidad del ADN al neutralizar sus cargar, provocando su precipitación en el alcohol etílico; para que esto sucediera se añadieron enzimas que digerían a nucleasas para evitar modificaciones al ADN. Al igual que se debía prestar atención al llevar a cabo la técnica, en cuanto a la temperatura del agua, el tiempo de licuación de la mezcla y la manera en que debían ser añadidos los elementos. No se realizaron pruebas para comprobar la pureza del ADN, pero debido a que al añadir ablandador de carne a algunos tubos, además del jugo de piña, se ocasionó que precipitara mayormente, se podría inferir que es una manera de obtener un ADN con un grado de pureza más alto en comparación con la adición de únicamente jugo de piña como degradador de proteínas, a bajo costo. El estudio de la molécula que lleva la información genética de los organismos, ADN, es de relevante importancia para los bioingenieros, para la investigación de organismos y la ingeniería genética.

 Bibliografía

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