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Biología molecularPRÁCTICA No. 7: EXTRACCION YCUANTIFICACION DE ADN TOTAL EN MUESTRADE SANGRECHRISTIAN GILVERTO ALVAREZ CARDENASDEL CARMEN SÁNCHEZ JESÚS JAVIER ________________HERNÁNDEZ MANRÍQUEZ ALDO BRAYAN ______________MARTÍN ANAYA JACQUELINE ________________________MEDINA RODRÍGUEZ ANALLELY ...

Description

Biología molecular PRÁCTICA No. 7: EXTRACCION Y CUANTIFICACION DE ADN TOTAL EN MUESTRA DE SANGRE CHRISTIAN GILVERTO ALVAREZ CARDENAS  DELCARMENSÁNCHEZJ ESÚSJ A VI ER_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _  HERNÁNDEZMANRÍ QUEZAL DOBRA Y AN_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _  MARTÍ NANA Y AJ ACQUEL I NE_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _  MEDI NARODRÍ GUEZANAL L EL Y_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ P ACHECORODRÍ GUEZMARI ANA_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _  ROMEROL ÓPEZOMAR_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _

4QBT5 QUÍMICA ÁREA BIOTECNOLOGÍA

OBJETIVOS 



Que el alumno aprenderá a los conocimientos y habilidades para extraer el ácido desoxirribonucleico genómico humano a partir de una muestra de sangre venosa purificada. Conocerá la forma correcta para la extracción de ADN y se guardara para futuras practicas

INTRODUCCION La extracción de ADN requiere hacer varias series de etapas básicas. En primer lugar tienen que romperse la pared celular y la membrana plasmática para poder acceder al núcleo de la célula. Después debe romperse igual la membrana nuclear para dejar libre el ADN. Por último hay que proteger el ADN de enzimas que puedan disminuirlo y para aislarlo hay que hacer que se precipite en alcohol. El ADN es soluble en agua, pero cuando se encuentra en alcohol se desenrolla y precipita en la interface entre el alcohol y el agua. Además de permitirnos ver el ADN, el alcohol separa el ADN de otros componentes celulares, los cuales son dejados en la solución acuosa. La sal evita la unión de las proteínas al ADN. (Aljanabi y Martínez, 1997). En la actualidad, el estudio de la variación genética entre individuos, poblaciones y especies para explicar patrones y procesos ecológico-evolutivos se aborda mediante marcadores moleculares, segmentos de ADN con o sin función conocida que proporcionan inform ación sobre la variación alélica y permiten distinguir individuos (Schlötterer 2004). Estos marcadores se obtienen con técnicas como la PCR (por las siglas en inglés de Polymerase Chain Reaction) y secuenciación, que hacen posible analizar la variación en la molécula del ADN con un detalle sin precedentes (Schlöttlerer 2004; Hudson 2008). Los datos moleculares han permitido estudiar con mayor precisión los patrones de diversidad genética y su distribución; el comportamiento; la selección natural; las interacciones biológicas; la composición, funcionamiento y dinámica decomu nidades microbianas; las relaciones filogenéticas, entre otros (Sunnucks 2000; Schlötterer 2004; Hudson 2008). La extracción consiste en el aislamiento y purificación de moléculas de ADN y se basa en las características fisicoquímicas de la molécula. El ADN está constituido por dos cadenas de nucleótidos unidas entre sí formando una doble hélice. Los nucleótidos están integrados por un azúcar (desoxirribosa), un grupo fosfato y una base nitrogenada (adenina, guanina, timina o citosina). La unión de los nucleótidos ocurre entre el grupo fosfato y el azúcar, mediante enlaces fosfodiéster, dando lugar al esqueleto de la molécula. (Clark, 2005). Usualmente diferentes tejidos requieren el uso de diferentes protocolos para purificar sus ácidos nucleicos. Muchas de las técnicas de extracción de ADN de plantas, hongos y células animales requieren del uso de nitrógeno líquido o que la muestra se encuentre liofilizada para la ruptura total del tejido (Aljanabi y Martínez, 1997). Los procedimientos de extracción convencional de ADN genómico, en algunas ocasiones no pueden remover en gran medida los compuestos inhibidores de la reacción de amplificación por PCR (polisacáridos, proteínas, sales minerales, etc.)

y por lo tanto limitan la sensibilidad de las diferentes reacciones en las cuales participa el ADN (Plaza et al., 2003).

Metodología (diagrama de bloques)

INICIO

Tubos con sangre + 300 μL de Tris-EDTA

Centrifugar a 3000 rpm durante 5 min a 4 °C

Agregar 100 μL de agua destilada y centrifugar

Agregar 100 μL de TrixtonX y centrifugar

50 μL de SDS + 50 μL de NaCl

100 μL Etanol frío y centrifugar

Decantar y agregar 100 μL TAE 1X

FINAL

RESULTADOS

Se toman 3 ml de muestra de sangre y se coloca en los tubos con 300 microlitros de tris-EDTA 0.1 M

Despues de ser centrifugada a 300 rpm

Se toma con una micropipeta la capa blanca y son llevadas a un tubo limpio

Resultado de retirar el tris-EDTA 0.1 M para posteriromente añadirle agua destilada y volverlo a centrifugar

Se le agrega 100 microlitros de agua destilada y se centrifuga a 5000 rpm durante 10m minutos a 4 °c

Este es el resultado en el cual se observa el adn con agua despues de ser centrifugado,

Se retira el agua destilada, se rotula el tubo y se incuba a -20°c

ANALISIS DE RESULTADOS Dentro de la extracción de ADN se tuvo en cuenta algunos puntos que permitieron la separación del material genético dentro de la primer fase se obtuvo la muestra de sangre. Posteriormente se pasó a hacer la separación de lípidos y proteínas En esta etapa se separa el ADN de las proteínas y lípidos mediante solventes orgánicos y ciclos de centrifugación. Se utiliza la fuerte tendencia hidrofílica de los grupos fosfato para separarlos en medios acuosos, mientras que las proteínas y los lípidos se separan en solventes orgánicos.La fase acuosa y la orgánica se

separan por centrifugación lo que permite aislar al ADN. Los solventes que se usan frecuentemente son el fenol, el cloroformo y el alcohol isoamílico . Estos reactivos contaminan fácilmente el ADN, por lo que se debe evitar acarrearlos en el proceso de purificación. Posteriormente se pasa a la fase de precipitación del ADN, después de que son eliminados los lípidos y las proteínas, se recupera el ADN. Para ello, se adiciona etanol y soluciones con altas concentraciones de iones de sodio o amonio que se unen a los grupos fosfato, esta mezcla reduce las fuerzas repulsivas entre las cadenas y permite que el ADN se pliegue sobre sí mismo haciéndolo insoluble. Un paso de centrifugación permite que el ADN permanezca en el fondo del tubo mientras que el etanol es desechado. Los restos de etanol se eliminan con un lavado con etanol al 70% y el remanente se elimina por evaporación.

En la imagen se puede apreciar las etapas de la extracción del ADN. La homogeneización y lisis celular son similares en ambos protocolos. Protocolo tradicional: separación de proteínas y lípidos con solventes orgánicos asi como también la precipitación del material genético mediante el método que se utilizo

CUESTIONARIO 1. Explica cómo actúa un detergente en la membrana celular

Los detergentes rompen la barrera lipídica solubilizando las proteínas e interrumpiendo la interacción lípido-lípido, lípido-proteína y proteína-proteína. Los detergentes, al igual que los lípidos, se asocian entre ellos y se unen a superficies hidrofóbicas. Se componen de una cabeza polar hidrofílica y una cola no polar hidrofóbica.

2. ¿A qué corresponde la densidad óptica para ADN (D.O.)? Este método proporciona una estimación simple y precisa de la concentración de una muestra, pero sólo si ésta se encuentra pura, sin contaminación significativa de proteínas o solventes orgánicos que absorben a longitudes de onda cercanas.

3. ¿Por qué considera usted que es necesario realizar la estimación de la concentración del ADN aislado? Este método proporciona una estimación simple y precisa de la concentración de una muestra, pero sólo si ésta se encuentra pura, sin contaminación significativa de proteínas o solventes orgánicos que absorben a longitudes de onda cercanas.

4. ¿Por qué se debe realizar una dilución de la muestra antes de medir la D.O. en el espectrofotómetro? Para evaluar la pureza de la muestra debe determinarse la proporción OD 260nm/OD 280nm.

5. ¿Por qué sólo se toma en cuenta la D.O. a 260 nm en la estimación de la concentración del ADN? Uno de los métodos más utilizados para la cuantificación del ADN es el análisis de la absorción UV, ya que los nucleótidos poseen máximos de absorción alrededor de 260 nm (por ejemplo, dATP: 259 nm; dCTP: 272 nm; dTTP: 247 nm).

6. ¿Qué información nos provee la D.O. a 280 nm? ¿Por qué utilizó el valor de 50 μgmL-1 en la fórmula para calcular la concentración de su muestra? Las bases nitrogenadas de los ácidos nucleicos tienen la capacidad de absorber luz ultravioleta, con un máximo a 280nm. Esta propiedad puede ser utilizada para calcular la concentración y pureza de los ácidos nucleicos gracias al empleo de un espectrofotómetro. En el caso del ADN bicatenario, una unidad de absorbancia a 280 nm (A280 = 1,0) corresponde a una concentración de 50 ug/ml.

CONCLUCIONES 

El ADN es el material genético a través del cual se transmite la información contenida en los genes de generación en generación

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El ADN está presente en los indicios biológicos como sangre, semen, saliva, huesos, pelo, etc. El salting out es uno de los métodos de extracción de ADN más utilizados por su fácil implementación, baja toxicidad de reactivos y permite una buena extracción de ADN. Para seleccionar un tejido como fuente de ADN debe reunir dos condiciones: contener gran cantidad de material genético y poseer baja actividad de DNAasa. El ADN es una molécula presente en todas las células de los seres vivos y es la encargada de codificar todo lo que nosotros somos, desde el color del pelo hasta las proteínas que tenemos en nuestra sangre. La proteinasa es una enzima que degrada las proteínas de las membranas celulares, por ello se le utiliza en los métodos de extracción de ácidos nucleicos.

REFERENCIAS  Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT, Mullis KB, Erlich HA. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science. 1988;239(4839):487-91.  Higuchi R, von Beroldingen CH, Sensabaugh GF, Erlich HA. DNA typing from single hairs. Nature. 1988;332(6164):543-6.  Schmitteckert EM, Prokop CM, Hedrich HJ. DNA detection in hair of transgenic mice—a simple technique minimizing the distress on the animals. Lab Anim. 1999 ;33(4):385-9.  Kaneshige T, Takagi K, Nakamura S, Hirasawa T, Sada M, Uchida K. Genetic analysis using fingernail DNA. Nucleic Acids Res. 1992;20(20):5489-90.  Uchida S, Wang L, Yahagi Y, Tokunaga K, Tadokoro K, Juji T. Utility of fingernail DNA for evaluation of chimerism after bone marrow transplantation and for diagnostic testing for transfusion-associated graftversushost disease. Blood. 1996;87(9):4015-6.  Oz C, Zamir A. An evaluation of the relevance of routine DNA typing of fingernail clippings for forensic casework. J Forensic Sci. 2000;45(1):158-60.  Vogelstein B, Gillespie D. Preparative and analytical purification of DNA from agarose. Proc Natl Acad Sci U S A. 1979;76(2):615-9....