GC BS4FS TEIL4 MDGC 160422 short PDF

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Summary

Es wurde exakt das besprochen was auf den Folien steht....

Description

4.

Kopplung von GC mit GC

• bei komplexen Proben kommt es auch bei der GC-Analyse zu Koelutionen  einfachstes Mittel zur QS: Verwendung zweier Säulen mit Eingangssplitter in einem GC-Ofen und zwei Detektoren („Zweisäulengerät“) • besser ist jedoch der Einsatz der zwei- oder multidimensionalen GC • Unterschied zwischen den beiden Techniken:

1. Multidimensionale GC ( MDGC) mit Heart- cut - Technik  ein Peak oder mehrere Peaks werden aus dem Chromatogramm der 1. Säule herausgeschnitten, auf eine 2. Säule transferiert und dort erneut getrennt (nur Ausschnitte gelangen auf die 2. Säule)

2. Comprehensive GC ( umfassende GC; GCxGC)  die gesamte Probe wird von der 1. Säule auf die 2. Säule transferiert und dort noch einmal (d.h. „umfassend“) getrennt 101

4.1

Zw eidimensionale o. Mult idimensionale GC ( MDGC)

• Säule 1 wird über ein moving capillary stream switching (MCSS)-System* mit Säule 2 gekoppelt  ein frei wählbarer Ausschnitt wird auf die zweite Säule transferiert • beide Säulen sind unterschiedlich belegt  koeluierende Komponenten, die mit dem Analyten auf die 2. Säule transferiert wurden, können nun abgetrennt werden • Säule 1: hier erfolgt die Vortrennung, das Chromatogramm wird im Detektor (z.B. FID) aufgezeichnet • Säule 2: „Feintrennung“, häufig mit einem Massenspektrometer (MS) als Detektor • im einfachsten Fall befinden sich beide Säulen in einem Ofen, besser ist jedoch die Verwendung zweier „GCs“ wie im Bild: 1: 2: 3: 4: 5:

Injektor 6: Verbindung Säule 1 7: Säule 2 (endet MCSS-System* in Detektor 2, Splitter hier: MS) Detektor Säule 1 (z.B. FID) 102

Transfer von Säule 1 auf Säule 2 a) mechanisches Umschaltsystem  Probleme: Totvolumen, Absorptionseffekte, Temperatureffekte a) Druckschaltsystem  Druckveränderungen (nehmen Einfluss auf die Retentionszeit an Säule 1) Druckmessung P Säule 1 im Normalbetrieb

Ventil

Retentionszeitverschiebung bei nachfolgenden Peaks Säule 1 mit heart- cut

• technisch gelöst durch automatische Druck-/ Flusskompensation

P – P1

P – P2

Probe

Säule 1

Säule 2

103

Methodenopt imierung / Qualitätskontrolle bei der MDGC • Festlegung der heart-cuts im Menü (s. Bild rechts)  Prüfung, anhand von Standards, ob alle heart-cuts quantitativ erfolgen  im Detektor 1 darf die herausgeschnittene (= auf die 2. Säule übertragenene) Verbindung nicht mehr detektiert werden Detektor 1. Säule vor den heart-cuts

Detektor 2. Säule nach > 20 heart-cuts (das Fehlen der Peaks belegt die gute Durchführung)

Im Menü werden die Schnitte (Start- und Endpunkte) festgelegt

104

Zur MDGC • die Festlegung der „Schnittstellen“ (heartcuts) an GC-1 erfolgt durch Injektion entsprechender Referenzsubstanzen  Ermittlung der exakten Elutionszeiten der Analyte • über das MCSS-System können nun Substanzen (Zeitsegmente; Teil der Probe) eines bestimmten Elutionsbereiches gezielt separiert, auf die zweite GC-Trennsäule transferiert und dort erneut getrennt werden  die Trennung in GC-2 erfolgt an einer stationären Phase unterschiedlicher Polarität Ziel: Verbindungen, die an der Trennsäule im GC-1 koeluieren, sollen nun getrennt werden • ggf. wird in GC-2 ein MS als Detektor eingesetzt • gut einsetzbar z.B. in der Aromaanalytik

an der Stelle des heart-cuts kein Signal im 1. Detektor

Säule 1

Säule 2

Analyse des „herausgeschnittenen” Peaks an der 2. Säule zeigt, dass der vormals einheitliche Peak von Säule 1 aus zwei Verb. bestand 105

4.1.1 Wichtigste Einsatzgebiete der MDGC • Lebensmittelbereich  enantioselektive Bestimmung chiraler Aromastoffe (2. Säule trennt enantioselektiv)  Trennung von cis-/trans -Isomeren (z.B. auch bei Fettsäuren) • Kosmetika  Untersuchung auf allergene Stoffe • Petrochemie  Best. von Aromaten in Erdöl und Untersuchung auf Oxidationsprodukte • Umweltanalytik  z.B. Riechstoffe in Abwasser • allg. Analyse komplexer Proben • allg. Qualitätskontrolle (Nachweis von Koelutionen) 106

4.1.1.1

Aromast offanalytik einer Mandarinenölprobe mit tels heart- cut MDGC

Irel

Detektor 1. Säule

11.0

12.0

13.0

Irel

14.0

15.0

[min]

Detektor 2. Säule

• mittels heart-cut ergab sich, dass der Peak bei ~11 min an Säule 1 in Wirklichkeit aus drei Verbindungen bestand • bei Aromastoffen ist nicht allein die Konz. einer Verbindung ausschlaggebend sondern ihr Aromawert • auch sehr „kleine Peaks “ können entscheidend zum Aroma beitragen

12.0

12.0

16.0

18.0

20.0

[min]

• umso wichtiger ist deren genaue Erfassung wie hier mittels MDGC 107

4.1.1.2

Enantioselekt ive Bestimmung von Limonen mit tels MDGC •

Irel

es wird nur die Zielverbindung auf die mit einer chiralen stationären Phase belegte 2. Säule übertragen, an der die Enantiomerentrennung erfolgt dabei können auch geringe Anteile eines zweiten Enantiomers gut bestimmt werden

ohne

heart-cut • 10

15

20

25

[min]

Detektor 1. Säule

Irel

Irel

Detektor 2. Säule (R)-Limonen

(S)-Limonen

13 10

15

20

25

achiral belegte 1. Säule

[min]

15

17 [min]

chiral belegte 2. Säule (vgl. { 121ff.} )

108

4.2 Comprehensive GC ( GCxGC) [ „umfassende GC“] •

Weiterentwicklung der MDGC (1992 patentiert von J. Phillips)

•

zunächst Einsatz in der petrochemischen Analyse (vgl. Anfänge der GC)

•

anstelle der Übertragung einzelner Zeitsegmente auf die 2. Säule (heartcuts), wird der gesamte Fluss von der 1. Säule auf die 2. Säule transferiert und dort erneut getrennt

•

damit dies erfolgreich gelingt, darf eine später auf die 2. Säule gelangte Komponente eine früher übertragene nicht mehr überholen  dies gelingt nur, falls die Trennung an der 2. Säule sehr schnell erfolgt  die zweite Säule ist sehr kurz und dünn (schneller Fluss)  die Trennung an der 2. Säule dauert nur wenige Sekunden

•

die technische Schwierigkeit war dabei die Übertragung des Trägergasstroms von der 1. auf die 2. Säule

•

gelöst mit sog. Modulatoren { 110}  Interface zwischen den zwei GC Säulen

•

Vorteil: man erhält ein zweidimensionales Chromatogramm

109

4.2.1 Modulatoren bei der GCxGC •

das Interface zwischen den zwei GC Säulen hat folgende Hauptfunktionen: (i) Akkumulation und Falle für das Eluat von der 1. Säule (ii) Refokussierung der Analyte (iii) schnelle Freisetzung auf die 2. Säule

•

wird zum Einfangen und Fokussieren der Analyte in den ersten Zentimetern der 2. Säule fast immer gekühlt und zwar entweder (a) mit Flüssig-CO2 …. oder …. (b) mit gekühltem N2: N2-Gas wird durch flüssigen Stickstoff geleitet

•

nach einer festgelegten Zeit wandert die Falle motorgetrieben schnell vorwärts • die fokussierte Zone mit dem Analyten wird nun der GC-Ofentemperatur ausgesetzt (durch Beendigung der Kühlung) und schnell wieder verdampft und als schmale Bande weiter chromatographiert •

es ist keine zusätzliche Heizquelle erforderlich, es gibt jedoch auch Modulatoren, bei denen zusätzlich beheizt werden kann

•

optional kann die Probe mit Hilfe eines Eingangssplits verdünnt werden, so dass die Belastbarkeit der 2. (dünnen) Säule nicht überschritten wird 110

Schematische Beschreibung der Modulation •

typischer Aufbau (links) mit (a) allg. Aufbau des „Dual-Jet“-Modulators

(b) ein rechtsseitiger Jet (CO2-Einspritzung) friert Analyte ein, die von der 1. Dimension eluieren  die eingefrorene Probe wird mechanisch weitertransportiert (nach einer fest-gelegten Zeit wandert die Falle motorgetrieben schnell vorwärts) (c) der rechtsseitige Jet wird abgestellt, der kühle Punkt heizt im Ofen schnell auf und der Analyt wird auf der 2. Säule freigesetzt  gleichzeitig wird ein linksseitiger Jet angeschaltet um zu verhindern, dass Material von der 1. Dimension herübergespült wird Eingang flüss. CO (d) der Prozess beginnt von vorne 2

Ventile

I nj ektor

Jets

1. Säule

Modulat or

2. Säule

Det ektor

Trägergas

a

Kühlung

b Kühlung

1. Säule

2. Säule

c Kühlung

GC Ofen 2 GC Ofen 1

d

111

4.2.1 Loop Modulator ( Komb. Kühlung/ Erw ärmung) •

der Loop-Modulator verwendet nur zwei Düsen (kalt und heiß), um die Temperatur an zwei Orten auf der Säule zu modulieren

heißer Jet kalter Jet Trägergas • die Säule durchläuft den Kreuzungspunkt der beiden Düsen zweimal

kalt

• der kalte Jet liegt immer an, der wärme Jet später und nur kurz • das thermische Modulationsverfahren führt zu scharfen Peaks  Peakbreite in der 2. Dimension: ~100 ms  Verbesserung der Auflösung und Nachweisgrenze

heiß 112

Einsäulen- und Zw eisäulengeräte •

für die 2. Säule ist nur ein kleiner Säulenofen erforderlich, dieser ist in der Regel im ersten Säulenofen integriert

113

4.2.2 Detektoren bei der GCxGC •

extrem geringe Peakbreiten (FWHM) von ca. 100 ms bei der GCxGC erfordern ein schnelles Detektionssystem

•

der Detektor muss bei den sehr schmalen Peaks eine ausreichende Zahl von Datenpunkten liefern, um qualitative und quantitative Genauigkeit zu ermöglichen

•

Abtastraten bis 250 Hz (Filterzeitkonstanten bis zu 4 ms)

•

mögliche GCxGC-Detektoren sind

• • • •

FI D ECD

Ein Detektor liefert i.d.R. nicht kontinuierlich sondern punktuell Signale. Die Punkte werden dann zur Peakfläche verbunden. Je mehr Punkte erfasst werden, desto exakter die Flächenbestimmung und damit das quantitative Ergebnis

Irel

bei Peak breiten von 100 ms ist ca. alle 10 ms ein Datenpunkt erforderlich

Time- of-Flight - MS ( Flugzeitmassenspektrometer, TOF- MS) Quadrupole der neuen Generation mit schnellen Datenaufnahmeraten (erreichbar sind 50 ( Full scan) bzw. 100 (selected ion monitoring ) Datenpunkte pro Sekunde)

114

4.2.3

Typische Dimensionen der GC-Säulen und klassische Kombinationen bei der GCxGC

•

die 1. Säule ist meist relativ unpolar mit hohem Auflösungsvermögen (z.B. DB-5, 15-30 m lang x 0,25-0,32 mm ID, df 0,1-1 μm)

•

die 2. Säule ist meist polarer oder chiral und im Vgl. zur 1. Säule sehr kurz (0,7 - 2 m) x 0,1 mm ID x df ~0,1 μm)  2. Säule ermöglicht eine sehr schnelle Trennungen (1 – 10 s)

•

der Einsatz zweier Säulen unterschiedlicher Polarität führt zudem zu gut strukturierten 2D-Chromatogrammen  z.B. erhält man bei der Paarung unpolare 1./polare 2. Säule in xRichtung eine Trennung nach Volatilität und in y-Richtung nach Polarität

Typisches Setup Säule 1: Länge i.d. Filmdicke

DB-5 30 m 0,25 mm 0,25 µm

Säule 2: Länge i.d. Filmdicke

Carbowax 1m 0,1 mm 0,1 µm

Analysenzeit:

20-40 min (1200-2400 s)

Analysenzeit:

3-10 s

115

4.2.4 •

Aufzeichnung der GCxGC-Chromatogramme

das Ergebnis wird als 2D-Konturplot aufgezeichnet, wichtig ist dabei:  der richtige Farbkontrast  die Möglichkeit, hineinzuzoomen  die Veranschaulichung von Haupt- und Minorkomponenten

Konturplot einer Lavendelölprobe •

Konturplot einer Fettsäurebestimmung

die Software bietet die Möglichkeit, Signale ab einem bestimmten Signal-zuRausch-Verhältnis (signal-to-noise , S/N) anzuzeigen  die Schwierigkeit liegt in der richtigen Wahl des S/N  wählt man es zu hoch, gehen einem Verbindungen durch die Lappen, wählt man es zu niedrig erhält man 2D-Chromatogramme mit unendlich vielen Peaks, die letztendlich aussagelos/nicht mehr auswertbar sind 116

Jeder Punkt kann einzeln aufgezeichnet w erden

Beliebige Ausschnitte können herausgegriffen und im Detail betrachtet w erden

117

4.2.5

Anw endungen der GCxGC

4.2.5.1 Fettsäuren in Humanplasma

C16

C18

C20

C22

• die auf einer vertikalen Linie liegenden Verbindungen koeluierten an der 1. Säule

• es können nun auch Spurenkomponenten detektiert werden

• gute Trennung nach Kettenlänge (1. Säule unpolar) und Zahl der Doppelbindungen (DB) (2. Säule polar)

118

Aromaprofil in geröstetem Kaffee Arabica

2. Dimension

4.2.5.2

1. Dimension • •

unüberschaubar viele Verbindungen sind nachweisbar  sind alle Verbindungen Analyte (oder auch Matrix, Säulenbluten etc.???)  es gibt viel zu tun… 119

4.2.5.3 Enant ioselektive Bestimmung chiraler synthet ischer Moschus-Duftstoffe mittels GCxGC •

verbesserte Trennleistung mittels GCxGC am Beispiel der enantioselektiven Bestimmung von HHCB und AHTN AHTN

RT 2 (Wax) [s]

O

4R,7S-HHCB (Galaxolide) (weltweit am häufigsten eingesetzte synthetische Moschusverbindung)

4S,7S HHCB

4R,7R HHCB

O

4S,7R HHCB 4R,7S HHCB

6R-AHTN (Tonalide) RT 1 (chiral) [s]

• •

(weltweit die Nr. 2)

hier wurde in der 1. Dimension eine chirale stationäre Phase eingesetzt die als Racemate eingesetzten Verbindungen können in der Umwelt enantioselektiv abgebaut werden 120

5. GC-Enantiomerentrennungen •

die Enantiomere R und S weise gleiche physikochemische Eigenschaften auf

•

bei Wechselwirkung mit einer chiralen Umgebung U bilden sich Komplexe mit zwei Chiralitätszentren 

Diastereomere

R

U S R U

unterschiedliche Eigenschaften bieten wir dem Gemisch von R und S eine chirale Umgebung U an, mit der sie wechselwirken können, kann es zu unterschiedlich starken Komplexen kommen • der rechte Fuß passt besser in den rechten Schuh  die Geometrie (3D) ist entscheidend  genauso ist es bei der GC

SU

•

121

5.1

Cyclodextrin-Derivate als chirale stationäre Phasen ( CSP) für die enantioselektive GC -Cyclodextrin

• 6-8 -D-verknüpfte Glucose-Einheiten

1,53

• Hydroxy-Gruppen an C-2, C-3 und C-6 werden für die

0,79 nm

GC regioselektiv alkyliert (Methyl-, Ethyl-, Pentyl-), acyliert und/oder silyliert (tert.-butyldimethylsilyl-Rest) OR

C-6-Positionen: sterisch am besten zugänglich

O H 3CO

OR O O H 3CO OCH3

O

OCH3

O

O

H 3CO

OCH3

OR

RO

C-2-Positionen: am acidesten

O

am unreaktivsten

H 3CO OCH3 O

2

OCH3

RO

C-3-Positionen:

3

H 3CO O

O

H 3CO OCH3 H3CO O

OCH3 O

O RO

Ringform

OR O

6 seitliche Ansicht

122

Einsatz von CSP für Enantiomerentrennungen •

> 50 CSP wurden bereits synthetisiert

•

keine einzelne CSP löst alle Trennprobleme, aber praktisch für alle Probleme gibt es eine Lösung

•

Trennerfolg an einer CSP ist nicht vorhersehbar  try and error

R1= R2 = Me - TBDM

•

häufig erfolgreich eingesetzte CSP bei der GC  permethyliertes  -Cyclodextrin (-PMCD)  6- O-tert-butyldimethylsilyl-2,3-di-O-methyl- -Cyclodextrin (-TBDM)

CSP = chirale stationäre Phase

123

5.2

Thermodynamische Grundgleichung -R,S(G) = -R,S(H) + TR,S(S) = RT ln KR/KS = RT ln 

freie Enthalpie

•

Enthalpie

Entropie

die Umwandlung in die van’t Hoff-Gleichung ergibt:

Trennfaktor  = t´R2/ t´R1

-R,S(G) = -R,S(H) + R,S(S) = R ln  T

T

•

fast alle Enantiomerentrennungen sind Enthalpie-kontrolliert  in der van´t Hoff-Gleichung wird die Entropie vernachlässigbar

•

die van´t Hoff-Gleichung vereinfacht sich demnach zu: -R,S(H) ≈ R ln  T

•

der Trennfaktor  (=die Trennleistung) sinkt mit steigender Temperatur  die Temperatur soll bei der GC-Enantiomerentrennung möglichst tief sein, um einen hohen Trennfaktors  zu erreichen 124  isotherme Arbeitsweise bei der GC-Enantiomererentrennung

5.2.1 GC-Enantiomerentrennung bei verschiedenen isot hermen Temperat uren Absenken der (isothermen)

 = 1,0

190 °C

Elutionstemperatur  = 1,0 •

je tiefer T, desto höher und desto länger tR

•

aber:  berücksichtigt als thermodynamische Größe nicht die Peakbreite!

 = 1,012  = 1,013

170 °C

160 °C

155 °C

125

5.3 Ermittlung der besten Bedingungen für eine GCEnantiomerentrennung ( in Abh. von der Temperatur) •

ob eine Säule ein Enantiomerenpaar trennen kann, lässt sich gegenwärtig nicht theoretisch vorhersagen  es geht nichts über probieren  Voraussetzung: Verfügbarkeit des Racemates

Vorgehensweise •

Einbau der Säule, Herstellung einer geeigneten Lösung des Racemates

•

1. Lauf: von der Starttemperatur mit einer langsamen Heizrate (~1 °C/min) hochheizen  Notieren der Retentionszeit und Berechnung der Elutionstemperatur

•

2. Lauf: von der Starttemperatur mit einer schnellen Heizrate bis auf die Elutionstemperatur vom 1. Lauf, dann isotherm weiter (bis zur Elution)

•

3. Lauf: wie 2. Lauf nur isotherme Temperatur leicht senken (z.B. um 2 °C)

•

Folgeläufe: isotherme Temperatur weiter absenken bis eine Enantiomerentrennung erreicht wird oder es sich zeigt, dass an der verwendeten Säule keine Enantiomerentrennung möglich ist

126

5.4 Angabe des Ergebnisses bei Enantiomerentrennungen • liegen in einer Probe beide Enantiomere vor, so bestimmt man das Enant iomerenverhältnis ( enantiomeric ratio , ER) über das Verhältnis der Peakflächen der Enantiomere im Chromatogramm: ER = R /S

oder:

ER = 1. Peak / 2. Peak

 falls R und S nicht bekannt sind • der Enantiomerenüberschuss (enantiomeric excess, EE) ist gleich der Anteil, mit dem das vorherrschende Enantiomer überwiegt (%): EE = R-S / R+S Bsp.:

ER =9

bedeutet, dass 90% in R- und 10% in S-Form vorliegen

damit ergibt sich: EE = 90-10 / 90+10 = 0,8 oder 80%

127

5.5

Anw endungen von GC-Enantiomerentrennungen

• Aromastoffanalytik { 108}  Echtheitsprüfung  chirale Verbindungen liegen in Naturprodukten seltenst als Racemat vor  meist dominiert ein Enantiomer stark oder liegt gar ausschließlich vor  „D-Zucker“, „...