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Pontificia Universidad Católica del Ecuador Escuela de Bioanálisis Carrera: Bioquímica

Guía de Laboratorio de Inmunohematología

Autor: Máster Rosa Chiriboga Ponce [email protected]

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Tabla de contenido PLANIFICACIÓN Y EVALUACIÓN DE PRÁCTICAS

N° 1 2 3 4

Nombre de la práctica Preparación de células para pruebas inmunohematológicas Determinación del grupo sanguíneo directo e inverso/sérico Identificación de subgrupos de A Identificación del factor Rh y sus variantes

Fecha 26-30 de agosto 2019 2-6 de septiembre 2019 9-13 de septiembre 2019 16-20 de septiembre 2019 23-27 de septiembre 2019

5 PRUEBA PARCIAL I Fenotipificación del sistema Rh 6

30 -4 de octubre 2019

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7-11 octubre 2019

Resolución de casos relacionados a discrepancia de grupo ABO-factor Rh y fenotipos CDE/cde. Rastreo de anticuerpos irregulares metodología en gel 8 9 Estudio de anticuerpos irregulares metodología en tubo 10 PRUEBA PARCIAL II

14-18 octubre 2019 21-25 octubre 2019 28-01 noviembre 2019

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Pruebas cruzadas-Coombs indirecto

04-08 noviembre 2019

12

Pruebas Cruzadas-Coombs Directo y Control de Coombs

11-15 noviembre 2019

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Observación del proceso de donación en banco de sangre: Campañas-Entrevistas al donante

18-22 noviembre 2019

14 PRUEBA PARCIAL III 25-29 noviembre del 2019 15 Observación de producción en banco de sangreserología-hemocomponentes. Elaboración de un ensayo relacionado con el control de 16 calidad en producción de hemocomponentes (CPQ, CGR) 17 Trabajo en un banco de sangre Final

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02-06 diciembre 2019 09-13 diciembre 2019

Tabla de contenido 1.

Introducción ............................................................................................................................... 4

2.

Reglamento del Laboratorio.................................................................................................... 6

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Bioseguridad en Laboratorio de Inmunohematología ......................................................... 8

Práctica N°1....................................................................................................................................... 9 Título: Preparación de células para pruebas inmunohematológicas.................................... 9 Práctica N°2-A................................................................................................................................. 12 Título: Determinación del Grupo Sanguíneo (directo) en tubo y placa. ............................. 12 Práctica N°2-B................................................................................................................................. 18 Título: Determinación del Grupo Sanguíneo (indirecto). ...................................................... 18 Práctica N°3..................................................................................................................................... 22 Título: Determinación de subgrupos de A (A1-A2) ............................................................... 22 Práctica N°4..................................................................................................................................... 26 Título: Determinación del factor Rh y confirmación del Du .................................................. 26 Práctica N°5..................................................................................................................................... 30 Título: Determinación del fenotipo del factor Rh ................................................................... 30 Práctica N°6..................................................................................................................................... 33 Título: Resolución de casos relacionados a discrepancia de grupo ABO-factor Rh y fenotipos CDE/cde. .................................................................................................................... 33 Práctica N°7-8 ................................................................................................................................. 34 Título: Identificación de Anticuerpos Irregulares ................................................................... 34 Práctica N°9..................................................................................................................................... 36 Título: Pruebas Cruzadas ......................................................................................................... 36 Práctica N°10 .................................................................................................................................. 39 Título: Test Coombs Directo-Prueba en tubo ........................................................................ 39 Práctica N°11-12............................................................................................................................. 42 Título: Observación del proceso de donación en banco de sangre: CampañasEntrevistas al donante y observación del control de calidad en banco de sangreserología-hemocomponentes ................................................................................................... 42 Bibliografía ....................................................................................................................................... 43

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1. Introducción Las pruebas de laboratorio realizadas en las prácticas inmunohematológicas son esenciales dentro de la práctica de medicina transfusional, ya que del resultado de las mismas va a depender la vida de una persona. Es por esta razón que se han formulado leyes nacionales que comprometen al Estado Ecuatoriano en garantizar la seguridad transfusional así: De acuerdo a la Ley Orgánica de Salud del Ecuador en el artículo 70 dispone: “Se declara de prioridad nacional la disponibilidad de sangre segura y sus componentes. El Estado, a través de la autoridad sanitaria nacional, tomará las medidas necesarias para garantizar la disponibilidad y el acceso a sangre y componentes seguros en cantidades suficientes para quien la necesite, siendo obligatorio su provisión en las instituciones públicas, privadas y autónomas, en caso de riesgo inminente para la vida, independientemente de la capacidad de pago…… Adicionalmente, la autoridad sanitaria nacional está obligada a promover la donación voluntaria y altruista de sangre.”. (Ministerio de Salud Pública del Ecuador, 2008). Actualmente, para el funcionamiento del Sistema Nacional de Sangre y aprovisionamiento de hemoderivados, el MSP se encuentra estableciendo políticas bajo el denominado Plan Nacional de Sangre (PNS) a partir del cual se formularán normas para mantener un abastecimiento de sangre de calidad, de manera oportuna y suficiente para las necesidades de la población (Ministerio de Salud Pública del Ecuador, 2008). Ley establecida en el Reglamento Oficial CAPÍTULO II DE LA SANGRE, SUS COMPONENTES Y DERIVADOS, Art. 3.- menciona “Para el funcionamiento del Sistema nacional de aprovisionamiento de sangre y la red de servicios de sangre, el Ministerio de Salud Pública dictará las políticas y establecerá el Plan Nacional de Sangre (PNS), a partir de los cuales se formularán las normas y procedimientos que permitan lograr el aprovisionamiento, procesamiento, disponibilidad y utilización de sangre, hemocomponentes y derivados seguros y de calidad, de manera oportuna y en cantidad suficiente para atender las necesidades de la población” (Tribunal Constitucional de la República del Ecuador, 2008). Y en el Art. 5.-menciona: que el Ministerio de Salud Pública establecerá normas y procedimientos para la donación, fraccionamiento, estudios serológicos (tamizaje), pruebas pretransfusionales, uso clínico y vigilancia de las reacciones transfusionales e implementará programas de educación continua en inmunohematología y alternativas transfusionales (Tribunal Constitucional de la República del Ecuador, 2008) . Bajo estas normas legales se establecen la obligatoriedad en la realización de las pruebas pre y pos transfusionales necesarias para garantizar una transfusión sanguínea inocua. Las metodologías utilizadas en las pruebas serológicas utilizadas en banco de sangre o Hemocentro puede ser en tubo, microplaca, centrifugación en columnas de gel o microcubetas de vidrio y la técnica en captura en fase sólida (Buelvas Cortés,Armado; Muñiz-Díaz,Eduardo; León de González,Gabriela, 2014); todas estas metodologías pueden ser aplicadas en la realización de pruebas pre transfusionales, relación fetomaterno, determinación de grupos sanguíneos, investigación e identificación de anticuerpos antieritrocitarios (Buelvas Cortés,Armado; Muñiz-Díaz,Eduardo; León de González,Gabriela, 2014). 4

Las pruebas en tubo representaron un avance técnico en relación a las de lámina y placas de opalina y continúan siendo utilizadas en algunos bancos de sangre y laboratorios privados en Ecuador, especialmente en aquellos con bajos recursos económicos o poco volumen de trabajo. La realización de esta técnica manual en tubo, aún posee dificultades en su proceso como son una falta de estandarización y subjetividad en la realización e interpretación de resultados especialmente a nivel de personal poco capacitado, lo que puede comprometer la calidad de los resultados (Buelvas Cortés,Armado; Muñiz-Díaz,Eduardo; León de González,Gabriela, 2014). Se han introducido la prueba inmunohematológica en columnas de gel a nivel de Hemocentros y Bancos de sangre con alto volumen de trabajo tanto en la ciudad de Quito como en Guayaquil (Cruz Roja, 2010). Esta técnica ha representado un avance técnico sobre la de “tubo” especialmente durante el proceso de ejecución ya que se ha estandarizado el procedimiento tanto de la elaboración como de la interpretación de reacciones eliminando los aspectos subjetivos de lecturas de resultados (Buelvas Cortés,Armado; Muñiz-Díaz,Eduardo; León de González,Gabriela, 2014). En el país, aún no se ha establecido un control de calidad en Inmunohematología, siendo un proceso que está encaminado a proteger y asegurar los resultados obtenidos, es por este motivo que el presente manual contiene información que aportará a los alumnos conocimientos descriptivos, basados en fundamentos científicos, tomados del Manual Técnico de Asociación Americana de Bancos de Sangre (Asociación Americana de Bancos de Sangre, 2012) instrumento referente de las técnicas aplicadas en la realización de pruebas transfusionales, poniendo énfasis en los fundamentos de dichas pruebas y en las buenas prácticas de manufactura BPM.

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2. Reglamento del Laboratorio El laboratorio representa el 50% de la calificación final de la materia de Inmunohematología. La calificación del laboratorio se distribuirá de la siguiente manera: 2.1 Trabajo Práctico 60%  Asistencia completa en las 16 prácticas programadas (incluido las semanas en que tomarán los exámenes parciales y final)  Puntualidad se tendrá una tolerancia de máximo 10 minutos  Mantenimiento del orden y limpieza de cada sitio de trabajo  Cada alumno deberá ingresar al laboratorio con mandil, guantes, cuaderno de laboratorio, sharpei, lápiz.  Llevará en cada sesión impresa la práctica de laboratorio correspondiente enviada por el docente al e-mail del curso o a la plataforma virtual. Esa práctica está incluida en este manual, sin embargo se cambiaran las preguntas de búsqueda bibliográfica en cada grupo de laboratorio.  El material de laboratorio y reactivos correspondientes estarán ubicados en un lugar determinado al que tienen acceso todos los estudiantes.  El alumno mantendrá las normas de bioseguridad: uso de guantes, cabello recogido, comunicación de incidentes y accidentes en tal caso se llenará un formulario de aviso y seguimiento (Anexo 2).  La permanencia del docente debe ser completa durante toda la práctica, por tanto el alumno podrá recibir instrucciones correctivas, aclaración de dudas e instrucciones para la obtención de resultados fiables. 2.2 Informe de Laboratorio 40% (Trabajo individual-asistido)  El alumno deberá enviar el trabajo en el día, horario y medio establecido por el docente, este puede ser vía e-mail, plataforma virtual o impreso.  El informe consta de tres partes:  Resultados Obtenidos y análisis de los mismos basado en el fundamento inmune de la prueba.  Conclusiones y Recomendaciones  Respuestas al cuestionario realizado por el docente en base de bibliografía sugerida en el Programa microcurricular de Inmunohematología o artículos científicos publicados en PUBMED.  El porcentaje de calificación se dividirá de la siguiente manera:  Resultados 20%  Conclusiones y Recomendaciones 15%  Cuestionario 25%  Discusión de resultados (diferentes a lo expuesto en clase o resumidos en la práctica) y Bibliografía citada 40%.

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2.3 Pruebas parciales y Examen Final Las pruebas parciales y examen final se tomarán en base a casos representativos de cada práctica realizada y constará de:  Realización de la prueba  Obtención de resultados (lectura e interpretación)  Reporte de resultados  Discusión de resultados. 2.4 Rúbrica de trabajo en laboratorio Se tomará en cuenta los lineamientos generales de laboratorio en cada una de las prácticas realizadas, basadas en la rúbrica (Anexo 1).

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3 Bioseguridad en Laboratorio de Inmunohematología 3.1 Normas generales de Bioseguridad 3.1.1 Las puertas del laboratorio deberán estar cerradas y el acceso restringido mientras se realice las prácticas de Inmunohematología. 3.1.2 Prohibido comer, beber, fumar, almacenar comidas, así también aplicarse maquillaje. 3.1.3 La ropa protectora como mandiles debe ser colocada el momento de ingresar al laboratorio de prácticas y retirados una vez concluidas. 3.1.4 Antes de iniciar la práctica el alumno deberá comunicar al profesor si tiene alguna laceración en la piel especialmente en las manos, en cuyo caso deberá ser protegida con gasas antes de colocase los guantes. 3.1.5 Una vez colocados los guantes el alumno/docente no podrá tocar ojos, nariz, picaportes, teléfono (celulares), llaves ni ningún elemento que va a ser utilizado fuera del laboratorio. 3.1.6 Todos los procedimientos o pruebas que se lleven a cabo deben ser realizados para evitar la posibilidad de producir aerosoles, gotas, salpicaduras. 3.1.7 Los residuos deben ser eliminados en recipientes con cloro. 3.1.8 Los cortopunzantes en los destroyer 3.1.9 Antes de realizar la práctica el alumno deberá tomar en cuenta los posibles riesgos y precauciones que sea necesario tomar en eliminar o contrarrestar el peligro. 3.1.10 No se realizaran análisis no autorizados. 3.1.11 Todos los accidentes e incidentes de laboratorio deberán ser comunicados al docente inmediatamente. 3.1.12 Todos los materiales utilizados durante las prácticas deben ser adecuadamente descontaminados. 3.1.13 Los alumnos deberán utilizar guantes de látex de buena calidad para todo manejo de material biológico, especialmente en pruebas de laboratorio que exista riesgo de exposición a sangre. 3.1.14 Una vez terminada la práctica los alumnos descartaran el material utilizados en sus respectivos recipientes. 3.1.15 Procederán a la descontaminación de las mesas y limpieza de serofugas. 3.1.16 Una vez terminado los procesos retirarán sus guantes de látex los que serán depositados en un recipiente de basura contaminada (funda roja) y procederán al lavado de manos.

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Práctica N°1 Título: Preparación de células para pruebas inmunohematológicas Objetivos de aprendizaje: El estudiante aprenderá a:    

Comprender la importancia de la preparación previa de las células antes de su uso en las pruebas inmunohematológicas. Realizar un lavado manual adecuado de acuerdo a la procedencia de las muestras sean estas de sangre total o de cordón umbilical. Preparar eficientemente una suspensión de células rojas de diferentes concentraciones 2%, 3%, 5%, 10%. Diferenciar la concentración de las suspensiones de células rojas de acuerdo al tono de coloración.

1. Introducción El lavado manual o automático de las células sanguíneas asegura que se eliminen en forma adecuada las globulinas no unidas a los eritrocitos, ya que estas pueden reaccionar con ciertos reactivos utilizados en las pruebas de Banco de Sangre. Al realizar pruebas inmunohematológicas con suspensión de glóbulos rojos, la solución salina utilizada debe mantener un pH de 6,5-7,0 por fuera de este rango se pueden producir falsos negativos debido a que ciertos anticuerpos presentes en los reactivos no se combinan con los antígenos eritrocitarios (Organización Mundial de la Salud, 2008). La preparación de la suspensión de células, debe lograr la proporción célula/solución salina apropiada para la mayoría de las pruebas realizadas en banco de sangre, ya que establece el número de glóbulos rojos adecuados, para realizar una lectura apropiada y diferenciar los grados de intensidad de la reacción. 2. Práctica 2.1 Reactivos 1) Sangre completa (EDTA) 2) Sangre de cordón umbilical (si está disponible, caso contrario se simulará contar con este tipo de muestra) 3) Solución salina fisiológica al 0.85% ó 0.9%: Preparación: Cloruro de sodio 8,5gr Agua destilada 1.000ml 2.2 Materiales: Tubos de vidrio Pipetas Pasteur

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3. Procedimiento: 1) Colocar 2ml de sangre con anticoagulante y/o de cordón umbilical en un tubo limpio 2) Preparar la solución salina al 0,85% 3) Llenar cada tubo ¾ partes con el uso de una piceta. 4) Mezclar 5) Centrifugar por 1 minuto a 3.000rpm 6) Sacar de la centrifuga y decantar el sobrenadante con el uso de la pipeta Pasteur. 7) Repetir desde el paso 3, tres veces el mismo procedimiento en el caso de sangre completa y 10 veces en el caso de sangre de cordón umbilical. 8) En la última lavada descartar el sobrenadante completamente 9) Re suspender el botón de células 10) Rotular 4 tubos: 2%-3%-5%-10% 11) Colocar la cantidad necesaria de células en cada tubo de acuerdo a los cálculos que usted realice. 12) Preparar las diferentes diluciones con un volumen final de 5ml.

2% 3% 5% 10%

5ul 150ul 250ul 500ul

5000ml 5000ml 5000ml 5000ml

Ejercicio: Realizar los siguientes cálculos: Solución Salina al 2% VF 1000ml Solución Salina al 3% VF 150ml Solución Salina al 5% VF 250ml Solución Salina al 10% VF 10000ml Describir el color que obtuvo en cada dilución.

Informe de Laboratorio: Siga el formato de Informe de Laboratorio (Anexo 3) 1. Consultar porqué es importante elegir una dilución adecuada de células para las pruebas que se llevan a cabo en Banco de Sangre. 2. Porqué se utiliza solución salina a ese porcentaje, cuál es la importancia de esto?. 3. Si usted tiene células provenientes de cordón umbilical porqué razón debe lavarlas 10 veces, que evita esto en las pruebas?. 10

4. ¿Para realizar pruebas de banco de sangre en equipos automatizados no se realiza el lavado de células sanguíneas, porqué razón no se sigue este proceso? Analice su respuesta. 5. Además de la solución salina al 0,85% que otras soluciones se utilizan para diluir los glóbulos rojos para ser utilizados en pruebas de banco de sangre. Caducidad: Para resultados adecuados utilizar la suspensión de glóbulos rojos recién preparada. (Asociación Americana de Bancos de Sangre, 2012) Bibliografía Utilizar el formato APA: Usar el siguiente link. http://tutorialsibusach.pbworks.com/w/page/22541880/Estilo%20APA Bibliografía recomendada: Manual Técnico de la AABB. Informe debe ser enviado al e-mail [email protected] Las correcciones y retroalimentación se realizaran en forma individual en cada informe y grupal en clases teóricas.

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Práctica N°2-A Título: Determinación del Grupo Sanguíneo (directo) en placa. Objetivo de aprendizaje: Al terminar la práctica el estudiante será capaz de:    

Utilizar correctamente los diferentes anti-sueros (reactivos) para identificar en el laboratorio los grupos sanguíneos del sistema AB...