Guia de Problemas de Enzimologia y Cinetica Enzimatica PDF

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CÁTEDRA: BIOQUÍMICA Carreras: Farmacia Profesorado en Química Licenciatura en Química Licenciatura en Alimentos

ENZIMOLOGÍA Y CINÉTICA ENZIMÁTICA Definiciones útiles  Unidad de enzima (U): cantidad de enzima que cataliza la conversión de 1 mol de sustrato en producto(s) en 1 minuto de reacción, bajo condiciones previamente determinadas.  Actividad enzimática o concentración de enzima: unidades de enzima por ml de solución. (U/ml)  Actividad específica (U/mg): actividad enzimática (U/ml)/concentración de proteínas (mg/ml) de la solución.  Índice de recambio (min-1 ó s -1): a) número de moles de sustrato transformados por minuto por mol de enzima (actividad molar ó molecular). b) si es una enzima con n subunidades, cada una con un sitio activo, es el número de moles de sustrato transformados por minuto por mol de subunidad activa o centro catalítico (actividad de centro catalítico)  Ciclo catalítico (min ó s): tiempo que transcurre un ciclo catalítico.  Katal: cantidad de enzima que cataliza la conversión de 1 mol de sustrato en producto (s) en 1 segundo. Actividad específica: katal/kg de proteína. Para resolución de tablas de purificación: .Actividad total: Actividad enzimática x volumen total. .Proteínas totales: Concentración de proteínas x volumen total. .Rendimiento parcial (%): (Actividad total etapa/Actividad total etapa anterior) x 100. .Rendimiento total (%): (Actividad total etapa/Actividad total primera etapa) x 100. .Purificación parcial: Actividad específica etapa/ Actividad específica etapa anterior. .Purificación total: Actividad específica etapa/ Actividad específica primera etapa. ENZIMOLOGÍA: PROBLEMAS: 1- Sea la reacción A+B  AB. Concentraciones iniciales de A y de B de 1 mM y 2 mM respectivamente llegan al equilibrio después de 45 horas de incubación. Las concentraciones en el equilibrio son [A]= 0,5mM, [B]=1,5 mM y [AB]=0,5 mM. En presencia de una enzima adecuada el equilibrio se alcanza en un minuto. ¿Cuales serán las concentraciones alcanzadas en este caso? ¿Cuál es el valor de la Keq en ambos casos? 2- Un extracto libre de células de Escherichia coli contiene 24 mg de proteína por mililitro. Veinte microlitros de este extracto en un volumen de incubación patrón de 0,2 ml catalizaron la incorporación de la glucosa-14C al glucógeno con una velocidad de 1,6

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nmoles/min. Calcular la actividad expresada (U/ml) y la actividad específica (U/mg) en la cubeta y en la muestra. 3- Un extracto crudo libre de células contiene 20 mg de proteína por mililitro. Diez microlitros de este extracto en un volumen de reacción total de 0,5 ml catalizaron la formación de 30 nmoles de producto en un minuto en condiciones de ensayo óptimas (pH y fuerza iónica, concentraciones saturantes de todos los sustratos, coenzimas, activadores y otros). (a) Expresar la velocidad inicial vi en mM/min. (b) ¿Cuál será vi si los mismos 10 µl del extracto se ensayaran en un volumen total de 1,0 ml? (c) ¿Cuál es la concentración de enzima en la mezcla de ensayo y en el extracto (en U/ml)? (d) ¿Cuál es la actividad específica de la preparación? 4- Quince microlitros de la preparación de una enzima catalizaron la producción de 0,52 µmoles de producto en un minuto en condiciones óptimas en un ensayo patrón (a) ¿Cuánto producto se producirá en un minuto por 150 microlitros de la preparación en las mismas condiciones de reacción? (b) ¿Cuánto tiempo necesitarán los 150 microlitros de la preparación para producir 0,52 micromoles de producto en las mismas condiciones de ensayo? 5- Una enzima pura tiene una actividad específica de 120 unidades/mg de proteína. (a) Calcular el índice de recambio si el PM= 360000. (b) Calcular el tiempo requerido para un ciclo catalítico. 6- Un microgramo de una enzima pura (PM= 92000) catalizó una reacción a la velocidad de 0,5 µmoles/min en condiciones óptimas. Calcular (a) la actividad específica de la enzima expresada en U/mg de proteína y en U/mol, (b) el índice de recambio y (c) ¿cuánto tiempo dura un ciclo catalítico? 7- Una preparación comercial de enzima tiene una actividad específica de 42 U/mg de proteína y contiene 12 mg de proteína por mililitro. Para corroborar estos datos un operador ensaya una medida de actividad de la enzima en un medio de reacción de 1 ml. El método utiliza una concentración de sustrato en el medio de 30 mM y un tiempo mínimo de lectura de 1 min. El volumen mínimo de la preparación enzimática que se puede utilizar es de 5 l. (a) ¿Puede el operador hacer el ensayo o debe diluír previamente la preparación? (b) En caso de que deba diluír y suponiendo que la enzima se descompone si lo hace, ¿qué actitud debería tomar el operador? 8- Las -lactamasas son enzimas capaces de hidrolizar la penicilina según la reacción: penicilina + H2O  ácido peniciloico. Esta reacción puede estudiarse monitoreando el descenso de absorbancia a 230 nm (coeficiente de absorción = 1,09 mM-1cm-1). Se determina la actividad de -lactamasa en una muestra cuya concentración de proteína es de 20 g/ml empleando penicilina a concentración saturante (1mM) en amortiguador de pH 7 y t =30C, observándose una diferencia en la absorbancia de 0,3 para un tiempo de 100 segundos. El volumen final en la cubeta de reacción es 2 ml, el camino óptico 1 cm y el volumen de muestra empleado es 15 l. ¿Cuáles son la actividad en U/ml y la actividad específica de la muestra? 9- La actividad de una muestra de láctico deshidrogenasa (LDH) pura con una concentración de proteína de 2 mg/ml se ensayó por un método discontínuo (aparición de piruvato). Diez microlitros de la muestra se incubaron con concentraciones

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saturantes de lactato y NAD+ en un volumen final de 3 ml. Luego de 3 minutos la reacción se detuvo por la adición de 0,5 ml de DNFH (reactivo de color). Después de 10 minutos se agregaron 1,5 ml de NaOH 0,4 N y se midió la absorbancia de la hidrazona formada a 505 nm. Se obtuvo una variación de absorbancia de 0,6. Para realizar la curva de calibración de la reacción del piruvato con la DNFH se trabajó en idénticas condiciones utilizando una solución de ácido pirúvico (PM= 88) conteniendo 4,4 mg/ml. Los valores obtenidos se muestran en la tabla. Calcule el número de recambio de la LDH considerando que el PM de la enzima es 130000 y que posee dos sitios activos por molécula. ml de testigo absorbancia

0,00 0,05

0,05 0,15

0,10 0,25

0,20 0,44

0,30 0,66

0,40 0,85

10- Cincuenta mililitros de un extracto libre de células que contenían 24 mg de proteína por ml del mismo y cuya actividad era de 0,08 U/ml se fraccionaron por precipitación con sulfato amónico. La fracción que precipitaba entre el 30% y 50% de saturación se redisolvió en un volumen total de 10 ml y se dializó. La disolución después de la diálisis ocupaba 12 ml y contenía 30 mg de proteína por ml. Veinte microlitros de la fracción purificada catalizaron la reacción de la fosforilasa con una velocidad de 5,9 nnmoles/minuto en condiciones de un ensayo patrón. Calcular (a) la recuperación de la enzima y (b) el grado de purificación obtenido mediante la etapa del sulfato amónico. 11- Un extracto crudo libre de células de músculo esquelético contiene 32 mg de proteína por ml. Diez microlitros del extracto catalizaron una reacción con una velocidad de 0,14 moles/min en condiciones óptimas en un ensayo patrón. Cincuenta ml del extracto se fraccionaron por precipitación con sulfato amónico. La fracción que precipitó entre el 20% y 40% de saturación se redisolvió en 10 ml. Esta solución contenía 50 mg de proteína/ml. Diez microlitros de esta fracción purificada catalizaron la reacción con una velocidad de 0,65 moles/min. Calcular (a) el porcentaje de recuperación de enzima en la fracción purificada, y (b) el grado de purificación obtenido por el fraccionamiento. 12- Se purificó una enzima obteniéndose los datos que se indican a continuación: FRACCIÓN I II III IV

VOLUMEN (ml) 1800,0 75,0 20,0 1,5

ACTIVIDAD (U/ml) 0,23 3,00 5,00 40,00

PROTEÍNA (mg/ml) 12,5 14,0 1,0 0,5

Construya una tabla de purificación. 13- Con los siguientes datos confeccione una tabla de purificación para una deshidrogenasa indicando luego: (a) ¿Cuál es la purificación total alcanzada?; (b) ¿Cuál es la etapa individual que dio mayor purificación? (c) ¿Cuál es el rendimiento total? (d) Analice la tabla obtenida y señale si todas las etapas empleadas están justificadas. Fundamente su respuesta. FRACCIÓN

VOLUMEN (ml)

A/min

PROTEÍNA (mg/ml)

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Extracto crudo Sulfato de amonio CM-celulosa Sephadex-G25

1000,0 20,0 100,0 100,0

124 3100 496 496

5 10 2 1

Coeficiente de absorción a 340 nm = 6,2 mM-1cm-1. 14- La enzima gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (NADP+ dependiente) cataliza la siguiente reacción: 1,3-bisfosfo-glicerato + NADPH + H+  gliceraldehido-3-fosfato + NADP+ + Pi Al purificar esta deshidrogenasa de A. nidulans, se obtuvieron por sonicación de células enteras 120 ml de un extracto crudo conteniendo 25 mg/ml de proteína y 20 U/ml de actividad enzimática. Posteriormente se realizó un fraccionamiento salino. La actividad enzimática se recuperó en la fracción 40-70 % de saturación con sulfato de amonio, esta fracción se redisolvió en 40 ml dando una concentración de proteína de 20 mg/ml y una actividad de 40 U/ml. Luego se realizó una cromatografía de afinidad con Rojo Proción (análogo de NADP+) donde la deshidrogenasa quedó unida pudiendo ser eluída con 0,7 M NaCl, recuperándose así 5 ml con una actividad de 240 U/ml y una concentración de proteína 0,4 mg/ml. Finalmente se realizó una cromatografía de exclusión molecular en Sephacryl-S300 donde se recuperaron 6 ml y 0,2 mg/ml de proteína. La actividad de la enzima fue medida como consumo de NADPH, cuyo coeficiente de extinción a 340 nm es 6200 M-1 cm-1 en un volumen de reacción de 3 ml y una cubeta de 1cm de paso de luz. El agregado de 2 l de esta última fracción produjo una disminución de absorbancia de 0,992 al cabo de 2 minutos. Construya la tabla de purificación. Indique cuál es el rendimiento y la purificación total alcanzados. Indique cuál es la etapa de mayor purificación y cuál la de mayor rendimiento. Indique si todos los pasos se justifican fundamentando su respuesta. 15- La enzima malato deshidrogenasa NADP+ dependiente cataliza la reacción malato + NADP+  oxalacetato + NADPH + H+ A partir de 500 g de hojas de espinaca se obtuvieron 1500 ml de un extracto crudo con una concentración de proteína de 20 mg/ml. La actividad se determinó con una alícuota de 30 microlitros midiéndose por un método continuo la aparición de NADPH a 340 nm (coeficiente de absorción del NADPH= 6200 M-1cm-1) en una cubeta de 3 ml y 1 cm de camino óptico obteniéndose una variación de absorbancia para 10 minutos de 1,24. Se realizó luego una cromatorafía en DEAE celulosa recogiéndose 180 ml que contenían 10 U/ml de actividad enzimática y 12,5 mg/ml de proteína. El paso posterior fue una columna de hidroxilapatita recogiéndose 10 tubos de 4 ml c/u con actividad de deshidrogenasa. La concentración de proteína en el conjunto fue de 0,94 mg/ml con una actividad de 22,5 U/ml. Como último paso se realizó una cromatografía en columna de Sepharosa 6B y se recuperó un volumen de 15 ml con una actividad de 50 U/ml y una concentración de proteína de 2,1 mg/ml. En base a estos datos construya la tabla de purificación indicando además (a) cuál es la purificación y el rendimiento total alcanzados, (b) cuál es la etapa individual de mayor purificación y cuál la de mayor rendimiento, (c) señale si todas las etapas empleadas se justifican; fundamente su respuesta. 16- A partir de un extracto libre de células se intenta purificar una enzima que cataliza la reacción: M + N  R + S

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La actividad enzimática se determina espectrofotométricamente aprovechando la propiedad del sustrato M de poseer un pico de absorbancia a 550 nm (coeficiente de extinción = 10,00 mM-1cm-1) que desaparece cuando se produce la reacción. Esta se realiza en cubetas de 1 cm de paso de luz, en un volumen de 2 ml. En una primera etapa se realizó un fraccionamiento con sulfato de amonio. La enzima precipitó entre el 60 y el 40 % de saturación. El precipitado obtenido fue resuspendido en un buffer de fosfato de potasio 100 mM y dializado contra el mismo. En el dializado se determinó actividad enzimática obteniéndose una variación de absorbancia (A/min) de 0,15. La concentración de proteína fue de 3 mg/ml. El volumen total dializado (100 ml) fue dividido en dos volúmenes iguales. Una de las fracciones fue sometida a filtración molecular por Sephadex G-100 mientras que la otra fue sometida a una cromatografía de intercambio iónico en DEAE celulosa. Las fracciones activas provenientes de la filtración molecular rindieron una preparación de 200 ml conteniendo 0,04 mg/ml de proteína. Del ensayo de actividad se obtuvo un A/min= 0,03. En cambio, las fracciones activas provenientes de la cromatografía de intercambio iónico rindieron una preparación de 50 ml conteniendo 0,02 mg/ml de proteína y el ensayo de actividad dió un A/min= 0,02. En todos los casos se emplearon 0,01 ml de las preparaciones correspondientes para el ensayo de actividad. (a) Calcule el rendimiento y la purificación para cada uno de los procedimientos alternativos empleados. (b) ¿Cuál de los dos procedimientos (Sephadex o DEAE celulosa) elegiría para purificar esta enzima? Fundamente. 17- Una enzima bacteriana que metaboliza la destrucción de un antibiótico ha sido estudiada en vías de obtener un método de purificación de la misma. La enzima cataliza la destrucción del antibiótico según una reacción que puede seguirse espectrofotométricamente a 540 nm con un coeficiente de extinción de 10 mM-1cm-1. La actividad del extracto crudo se determinó empleando una alícuota de 10 microlitros que produjo la aparición de 0,02 micromoles de producto en 5 minutos. Luego se intentaron dos protocolos de purificación a partir de un extracto crudo que tenía una concentración de proteína de 2 mg/ml en un volumen de 5 litros. La primera etapa, común a los dos protocolos, fue una precipitación con sulfato de amonio, etapa en la que se obtuvo un 60% de rendimiento y una purificación de 5 veces. El precipitado se redisolvió en 100 ml y con la mitad del material se realizó una cromatografía de afinidad seguida de una filtración por gel recogiéndose en esta última 25 ml con una actividad de 10 U/ml y una concentración de proteína de 2 mg/ml (método A). La otra mitad se sometió a una cromatografía de adsorción seguida de una de intercambio iónico obteniéndose un volumen de 5 ml con una actividad de 20 U/ml y una concentración de proteína de 1 mg/ml (método B). Calcule la actividad inicial del extracto crudo y las actividades finales obtenidas con cada método de purificación. Indique cuál método (A o B) emplearía para purificar la proteína y por qué. ¿Qué actividad recuperaría a partir del volumen total inicial? 18- Un grupo de investigadores que están estudiando la enzima L-glutamato deshidrogenasa de una bacteria deciden realizar la purificación de la misma. Luego de varios intentos diseñan un método de purificación. En la tabla que sigue se detallan los resultados obtenidos. FRACCIÓN Extracto crudo

VOLUMEN (ml) 220

ACTIVIDAD (U/ml) 42,0

PROTEÍNA (mg/ml) 21,0

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DEAE-celulosa Sulfato de amonio Sephadex-G50 Crom. de afinidad

35 20 60 10

224,0 157,5 50,0 279,8

16,0 10,5 2,5 1,6

(a) Complete la tabla. (b) Se decide omitir uno de los pasos de purificación a partir de los datos obtenidos, ¿cuál debería ser ese paso y por qué? ¿Cuál fue el paso que produjo la mayor purificación y cuál el de mejor rendimiento? (c) Dicha enzima reduce oxoglutarato a glutamato asociado a la oxidación de NADH a NAD+, lo que fue utilizado para seguir espectrofotométricamente la actividad de la enzima. En una preparación anterior 0,01 ml de enzima con una concentración de 10 mg/ml de proteína produjeron una variación de absorbancia de 0,125/min en condiciones óptimas. ¿Qué actividad específica tenía esa preparación? Volumen del ensayo: 1 ml; 340NADH: 6,22 mM-1 cm-1. 19- La asparaginasa cataliza la reacción: asparagina + H2O  aspartato + H3N Esta enzima es usada con fines terapéuticos en caso de leucemia. Las células tumorales en rápida división necesitan cantidades mayores de asparagina que las normales. La administración de asparaginasa reduce los niveles de asparagina disponible en los individuos enfermos, lo que reprime la viabilidad del tumor. Un laboratorio farmacéutico que desea comercializar asparaginasa le encarga que realice la purificación de la enzima del hongo Boticamyces pharmaceae. A tal fin, parte de 200 ml de un extracto crudo libre de células conteniendo 20 mg/ml de proteína. Para medir actividad enzimática incuba una alícuota de 10 l del extracto con el sustrato a 37C en 0,2 ml de medio de reacción, finalizándose ésta a los 5 min directamente por el agregado de 1 ml de reactivo de color para H3N. La lectura de absorbancia a 540 nm (descontando el blanco) en una cubeta de 1 cm de camino óptico fue de 0,44 ( para la reacción de color = 2200 M1 cm-1). Luego realiza un fraccionamiento salino, recuperando la asparaginasa en la fracción 40-80 % de sulfato de amonio. Al redisolver esta fracción en 20 ml del buffer de purificación Ud. recupera el 95% de actividad enzimática y 3800 mg de proteína. Luego realiza una cromatografía en columna de DEAE-celulosa y recupera 80 ml que contenían 600 U de asparaginasa (U es la cantidad de enzima que produce 1 mol de H3N por minuto en las condiciones de ensayo) purificada 20 veces respecto al extracto crudo. Como último paso realiza una cromatografía en columna de hidroxi-apatita de la que recupera 20 ml conteniendo 0,12 mg/ml de proteína y 17 U/ml de actividad enzimática. a- Construya la tabla de purificación y analícela, indicando la purificación y el rendimiento total alcanzados. Señale la etapa de mayor purificación y la de mayor rendimiento. b- ¿Aconseja iniciar la preparación de la asparaginasa en gran escala usando los mismos pasos de purificación o sugiere alguna modificación? Justifique su respuesta. 20- Se purificó prácticamente a homoqeneidad la dUTPasa (deoxiuridinatrifosfatasa) de Escherichia coli. Esta enzima hidroliza el dUTP a dUMP y PPi jugando un importante rol en la biosíntesis del dTTP para la replicación de DNA, ya que provee el sustrato para Ia timidilato sintetasa. Las etapas del procedimiento de purificación se indican en la siguiente tabla. Complete la tabla de purificación.

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FRACCIÓN

VOLUMEN (ml)

ACTIVIDAD PROTEÍNA (U/ml) (mg/ml) I 1690,0 0,134 2350,0 II 340,0 0,503 6060,0 III 440,0 0,208 173,0 IV 196,0 0,224 4,0 V 19,0 2,420 10,5 I = sobrenadante del lisado celular, II = fraccionamiento con sulfato de amonio, III = cromatografía en DEAE celulosa, IV = cromatografía en fosfocelulosa y V = filtración en Biogel P-150. 21- Se realizó la purificación de la enzima glucosa-6-fosfatasa que cataliza la siguiente reacción: glucosa-6-fosfato + H20  glucosa + fosfato Se partió de 200 g de hígado bovino obteniéndose un extracto inicial de 1200 ml que tenía una concentración de proteína de 10 mg/ml. Para medir actividad enzimática se incubó una alícuota de 50 microlitros con el sustrato a 30C en 1 ml de medio de reacción, cortándose ésta a los 10 min directamente por agregado de 2 ml de reactivo de color para fosfato. La lectura de Abs a 740 nm en una cubeta de 1 cm de camino óptico fue de 0,49 con un blanco de medida de 0,12 (el coeficiente de extinción para la reacción de color es de 3700 M-1 cm-1). Se realiza luego un corte con sulfato de amonio al 50 % rescatándose la fosfatasa en el precipitado. Este precipitado fue redisuelto en un volumen de 80 ml, siendo la concentración de proteína de 21 mg/ml y la actividad 6,3 U/ml. Posteriormente se realizó una cromatografía en Sephadex G-200 recogiéndose 10 tubos de 12 ml c/u con actividad enzimática. La concentración de proteína en el conjunto fue de 10,8 mg/ml y la actividad de 3,36 U/ml. Como último paso se realizó una cromatograf...