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UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA FACULTAD DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE FISIOLOGÍA Y BIOQUÍMICA GUÍA PARA EL LABORATORIO TEMA: HEMOLEUCOGRAMA NORMAS PARA EL INGRESO AL LABORATORIO: Leer y estudiar la guía de laboratorio con anterioridad (se requiere para optimizar el desarrollo de la práctica y su contenido puede ser utilizado como parte de la actividad evaluativa) Utilizar los elementos de protección personal (bata limpia y planchada, guantes). Llevar el cabello recogido, calzado cubierto y ropa cubierta (no usar faldas ni pantalón corto). No está permitido consumir alimentos ni bebidas, ni fumar dentro del laboratorio. Las maletas deben colocarse en la parte trasera del laboratorio. No realice procedimientos que no hayan sido autorizados por el profesor a cargo. Recuerde que el material contaminado debe ser depositado en las canecas rojas. El material cortopunzante debe ser depositado en el guardián dispuesto en la parte de atrás.

INTRODUCCION HEMATOLOGIA: Es el estudio de los tejidos hematopoyéticos y de la sangre, la cual necesita extraerse del organismo y en ocasiones separarse en sus diferentes componentes: plasma, suero y células, para ser analizados en búsqueda de alteraciones en dichos componentes. VELOCIDAD DE SEDIMENTACIÓN GLOBULAR (VSG) Ó ERITROSEDIMENTACIÓN (ESD) OBJETIVO Determinar en unidades de longitud y tiempo la propiedad que tienen los eritrocitos ó glóbulos rojos para formar pilas de monedas. Sirve como complemento diagnóstico en enfermedades hematológicas y no hematológicas. FUNDAMENTO La VSG se realiza por el método de Westergreen, considerado como el método de referencia internacional. La sangre anticoagulada con EDTA se coloca en una pipeta de vidrio en forma vertical y se deja en reposo durante una hora. Los eritrocitos tienden a caer al fondo de la columna y las proteínas plasmáticas (fibrinógeno, gammaglobulinas y otras) hacen resistencia a la caída. El valor de la VSG corresponde al punto donde las células se separan del plasma. En los individuos sanos la VSG ocurre lentamente y en procesos patológicos ocurre más rápidamente. En algunos casos es proporcional a la gravedad de la enfermedad. MATERIALES  Sangre con EDTA  Pipeta de Westergreen.

 Gradilla para sedimentación (Westergreen).  Reloj o timer. La pipeta es un tubo recto de 300 mm de longitud y 2.5 mm de diámetro y está graduada de 0-200 mm. Se coloca en forma vertical en la gradilla de su mismo nombre. FACTORES QUE INTERVIENEN EN LA VSG En general la sedimentación está afectada por propiedades de los eritrocitos, del plasma y por factores de tipo técnico. Entre ellos se encuentran:  Tamaño y forma de los eritrocitos.  Aglutinación de los eritrocitos.  Composición del plasma.  Viscosidad sanguínea.  Calibre y longitud del tubo.  Cantidad y calidad del anticoagulante.  Efecto de la temperatura y tiempo. METODOLOGÍA  Mezclar suavemente la muestra por inversión del tubo.  Utilizando el micropipetiador, aspirar la sangre y llenar la pipeta de Westergreen hasta la marca cero (0).  Llevar inmediatamente a la gradilla y fijar la pipeta evitando que se derrame la sangre.  Poner a correr el cronómetro durante 1 hora y leer exactamente cuando se cumpla este tiempo. IMPORTANCIA CLÍNICA: La VSG se utiliza como prueba de rutina en el diagnóstico inicial y seguimiento de múltiples enfermedades, es importante en la detección de entidades ocultas especialmente de origen neoplásico, en el seguimiento de enfermedades como la fiebre reumática, tuberculosis e infarto al miocardio y para establecer diagnósticos diferenciales. Por corresponder a un reactante de fase aguda se convierte en un marcador inespecífico no asociado a ninguna enfermedad en concreto, pero su elevación implica la existencia de un proceso inflamatorio, infeccioso o neoplásico. Cifras mayores de 100mm/h se han asociado con enfermedades malignas (Ca colón, Linfoma y Ca de mama). MEDICIÓN DEL HEMATOCRITO OBJETIVO Expresar en porcentaje (%) el número de células rojas empacadas en un volumen de sangre total. MÉTODO El hematocrito corresponde al volumen ocupado por los glóbulos rojos en relación con el volumen total de sangre. Puede obtenerse por centrifugación (micrométodo o microhematocrito) o por métodos electrónicos. Por micrométodo, se determina aplicando una fuerza centrífuga de 3.000 r.p.m. durante 3 minutos a una muestra de sangre total que está contenida en un capilar especialmente diseñado para esta prueba. MATERIALES  Sangre anticoagulada con EDTA.  Capilar.  Plastilina.  Centrífuga.

 Tabla de lectura de capilares de microhematocrito. METODOLOGÍA  Mezcle cuidadosamente la sangre anticoagulada por un minuto para obtener una buena homogenización.  Llene el capilar con sangre aproximadamente ¾ partes.  Selle el extremo inferior con plastilina.  Llevar a la centrífuga durante 3 minutos a 3000 r.p.m.  Después de centrifugar, retire el capilar y proceda a la lectura del hematocrito en la tabla correspondiente.  En el capilar se observan las células rojas empacadas, una capa blanquecina que corresponde a los glóbulos blancos y plaquetas (que sólo alcanzan un valor de 0.5 – 1 mm en condiciones normales) y el sobrenadante correspondiente al plasma (en él pueden observarse cambios en el color, normalmente = amarillo claro, Ictérico = amarillo fuerte, hemolizado = rojizo, ó lipémico = lechoso).  El volumen de células se lee desde cero (0) hasta donde termina la capa de glóbulos rojos y empieza la capa de blancos, la cual no se incluye en la lectura.

MEDICIÓN DE LA HEMOGLOBINA OBJETIVO Cuantificar la cantidad de hemoglobina presente en los glóbulos rojos. MÉTODO Método de la cianometahemoglobina: Al medir la hemoglobina se determina la suma de todas las formas de hemoglobina presentes en el eritrocito (oxihemoglobina, carboxihemoglobina, metahemoglobina y otras), lisando los glóbulos rojos para obtener un compuesto estable conocido como cianometahemoglobina, que puede ser medido en un espectrofotómetro, ya sea por métodos manuales o automatizados. FUNDAMENTO La mezcla de reactivo de Drabkin (CIANURO) con la sangre, transforma la hemoglobina en cianometahemoglobina. La intensidad del color de esta reacción se mide en un fotocolorímetro o espectrofotómetro. Pasos de la reacción: 1. Hemoglobina + ferrocianuro potásico = metahemoglobina. 2. Metahemoglobina + cianuro potásico = cianometahemoglobina. MATERIALES  Sangre venosa anticoagulada con EDTA o sangre obtenida por punción capilar.  Tubos de ensayo.  Pipeta de Sahli (20 landas = 0.02 ml) o pipeta automática.  Pipeta graduada de 5 ml.  Tapones de caucho o papel parafinado.  Fotocolorímetro debidamente calibrado.  Cubetas para el Fotocolorímetro.  Reactivo de Drabkin. El reactivo de Drabkin es tóxico, contiene cianuro. Evite el contacto con ojos, piel, mucosas.

INSTRUCCIONES DE PROCEDIMIENTO  Deposite 5 ml del reactivo de Drabkin en el tubo de ensayo.  Mida exactamente 20uL (0.02 ml) de sangre en la pipeta de Sahli.  Limpie los excedentes de sangre por fuera de la pipeta.  Lleve la pipeta hasta el fondo del tubo y deposite la sangre expulsando y aspirando varias veces para lavar internamente las paredes  Tape el tubo y mezcle suavemente por inversión.  Deje el tubo en reposo durante 10 minutos para que se produzca la hemólisis total de las células rojas y se complete la reacción.  Deposite la solución en la cubeta del Fotocolorímetro.  Lea la solución obtenida, usando como blanco el reactivo de Drabkin.  La concentración de hemoglobina se calcula multiplicando la absorbancia por una constante que resulta de la calibración del método. Ejemplo: Absorbancia de la muestra x 24.9= hemoglobina en g/dL MÉTODOS ELECTRÓNICOS En todos los analizadores semiautomatizados o automatizados, la hemoglobina se determina con la misma fundamentación del método manual (cianometahemoglobina), utilizando un hemoglobinómetro incorporado al instrumento. La OMS estableció como límites inferiores de normalidad valores: En el hombre 13 gr/dL y en mujeres 12 gr/dL. Por debajo de estos valores se consideran anemias. CONSTANTES CORPUSCULARES Ó ÍNDICES DE WINTROBE Son el resultado matemático de la relación entre la hemoglobina, el hematocrito y el recuento de eritrocitos por mm3. Determinan el tamaño y el contenido de hemoglobina de los eritrocitos bajo los conceptos del volumen corpuscular medio (VCM), hemoglobina corpuscular media (HCM) y concentración de la hemoglobina corpuscular media (CHCM). Estos tres promedios o constantes corpusculares de Wintrobe se constituyen en pilares para la clasificación MORFOLÓGICA de las anemias. 1. V.C.M = Volumen corpuscular medio. También llamado Promedio de Volumen Corpuscular (PVC) Se refiere al tamaño de los eritrocitos, se expresa en femtolitros (fL) y se obtiene al relacionar el volumen de células rojas empacadas (Hematocrito) y el recuento de glóbulos rojos, con la siguiente fórmula: Hematocrito VCM ó PVC = ----------------------------- x 10 Recuento de GR

Valor de Referencia 80-100fL

Una de las desventajas en el método clásico o manual es la variabilidad y el error en el conteo de los glóbulos rojos. Pero el VCM obtenido por métodos automatizados es mucho más confiable. En el neonato el VCM varía de la siguiente forma: En el recién nacido 106 fL; a la semana de nacimiento 101 fL, y durante la tercera y cuarta semana después del nacimiento alcanza los valores normales del adulto.

2. HCM = Hemoglobina corpuscular media. También llamada Promedio de Hemoglobina Corpuscular (PHC) Representa la cantidad de hemoglobina presente en cada eritrocito, expresada en picogramos (pg) como unidad de peso. Relaciona la concentración de Hemoglobina y el recuento eritrocitario, a través de la siguiente fórmula: Hemoglobina HCM ó PHC = -------------------------------- X 10 Recuento de GR

Valor Referencia 28-32pg

3. CHCM = Concentración de hemoglobina corpuscular media. También llamada Promedio de la concentración de Hb Corpuscular (PCHC) Relaciona el peso de la hemoglobina en un volumen total de eritrocitos (Hematocrito). Nos da una visión global de los niveles de hemoglobina y se expresa en g/dL. Se obtiene de la siguiente fórmula:

CHCM ó PCHC =

Hemoglobina (g/dL) -------------------------------- x 100 Hematocrito (%)

Valor Referencia 32-36g/dL

Las constantes corpusculares se utilizan para determinar el tipo morfológico de las anemias, de acuerdo al diámetro del glóbulo rojo y su contenido de hemoglobina. Es importante interpretar estos promedios de acuerdo con la evaluación morfológica de los glóbulos rojos, que se realiza por microscopía en un extendido de sangre periférica. A continuación se presenta un ejemplo de cómo se clasifica morfológicamente la anemia, según algunas combinaciones de datos de las constantes eritrocitarias: CLASIFICACIÓN DE LA ANEMIA Normocítica Normocrómica Macrocítica Normocrómica Microcítica Hipocrómica

VCM HCM 80-100fL - 28-32pg >100fL - ≥32pg < 80fL - < 28pg

-

-

CHCM 32-36g/dL - 32-36g/dL - < 32g/dL

La anemia microcítica hipocrómica típicamente se asocia con deficiencias de hierro y talasemias. La anemia macrocítica normocrómica se asocia en muchos casos con anemias megaloblásticas por deficiencia de vitamina B12 y/o ácido fólico. La anemia normocítica normocrómica puede relacionarse con hemorragia aguda, anemias hemolíticas, algunas hemoglobinopatías y la anemia por enfermedad crónica. RETICULOCITOS Son eritrocitos jóvenes que se diferencian de los glóbulos rojos maduros puesto que conservan en su citoplasma remanentes de RNA ribosomal, mitocondrias, aparato de golgi, los cuales pueden ser identificados mediante colorantes vitales (azul de cresilo brillante), haciendo que dicho RNA se precipite en forma de gránulos. VALORES NORMALES Valores relativos:  Adulto: 0.5 – 2.5 %  Recién nacidos: 2.6 - 6.5% (en dos semanas alcanza el valor de adulto). Valor absoluto: 22,5 – 147,5 x 109/L

INTERPRETACIÓN El conteo de reticulocitos es importante porque refleja la cantidad de células rojas viables que se producen en médula ósea (M.O). Una disminución en el número de reticulocitos se asocia con enfermedades como la anemia aplástica, las anemias carenciales y en general con la disminución en la producción de células rojas en M.O. Los reticulocitos se encuentran aumentados en anemias hemolíticas, anemias por deficiencias de hierro que reciben tratamiento y pérdidas de sangre agudas o crónicas. La producción de reticulocitos se puede estimar con base en la siguiente fórmula: % reticulocitos x Hematocrito del paciente % corregido: --------------------------------------------------------------------Hematocrito normal (45%) Índice de Producción de Reticulocitos (IPR) : % corregido 2 El valor obtenido es evidencia de la respuesta medular a las necesidades del individuo, cuanto más severa es la anemia mas inmaduro el reticulocito y por ende la respuesta medular debe ser mayor. Los valores del IPR permiten estimar los niveles de respuesta de la medula ósea. Si el valor es < 2 se considera que es una medula hipoproliferativa y si es ≥ 2 es hiperproliferativa....