Guión de prácticas Biología GME 1º C 2021 PDF

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Summary

El corazón está formado por 2 aurículas separados por el tabique interauricular y 2 ventrículos separados por el tabique interventricular (izquierdo y derecho)

La función del lado izquierdo del corazón es transportar el oxígeno a cada rincón del cuerpo

La función del lado ...

Description

NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO ES OBLIGATORIA LA UTILIZACIÓN DE LA BATA DE LABORATORIO, MASCARILLA Y GAFAS PROTECTORAS DURANTE TODAS LAS PRÁCTICAS.

• Los alumnos esperarán en el exterior del edificio y un profesor bajará a pasar lista a la puerta. • Antes de entrar al laboratorio, se medirá la temperatura a todos los alumnos que vayan a realizar las prácticas. • Tras esto cada uno de ellos dejará sus pertenencias en el punto indicado y procederá a lavarse las manos con gel hidroalcohólico antes de sentarse en su puesto. • Al llegar al puesto, se deberá limpiar la mesa y los aparatos que se vayan a utilizar (microscopios, lupas, micropipetas, etc.). • No se podrá prestar ningún material entre alumnos, cada uno irá al laboratorio con todo lo necesario, incluyendo el guión de prácticas que se llevará en una tablet o portátil. Solo podrá estar sobre la mesa el dispositivo con el guión y un rotulador de vidrio. • Cada alumno deberá tener, aparte de la bata, mascarilla y gafas protectoras que tendrá puestas durante todo el desarrollo de la práctica. • No se permite la entrada al laboratorio de comida o bebida. Durante las clases prácticas, los alumnos deberán abstenerse de comer, fumar o mascar chicle, evitando en todo momento llevarse a la boca lápices, bolígrafos u otros objetos, para evitar el peligro de contaminación.  Está PROHIBIDO USAR EL MÓVIL durante las prácticas.  En el laboratorio se debe llevar el pelo recogido y se tendrá especial precaución con la llama de los mecheros.  Al comienzo de cada una de las prácticas, el profesor expondrá verbalmente los fundamentos teóricos de la sesión correspondiente. El alumno deberá atender minuciosamente las indicaciones. Los trabajos no darán comienzo hasta haber recibido los alumnos las instrucciones pertinentes.  Si el alumno no ha comprendido lo que debe hacerse o tuviera alguna duda al respecto, deberá consultar al profesor antes de dar comienzo la práctica.  En caso de producirse algún accidente (quemadura, corte, rotura de material, derramamiento de cultivos, salpicadura en conjuntiva, etc.), o de observar alguna anomalía, el alumno deberá advertir inmediatamente al profesor, quien tomará las medidas oportunas.  No debe arrojarse por la pila, ni a la basura, los cultivos y materiales con los que se ha estado trabajando, hasta que no hayan sido esterilizados. Cualquier material sospechoso de contaminación deberá ser depositado en los recipientes de evacuación dispuestos a tal efecto.  Durante la clase práctica, el alumno velará por el buen uso del material e instrumental disponible. FINALIZADAS LAS PRÁCTICAS, EL ALUMNO RECOGERÁ MINUCIOSAMENTE EL MATERIAL UTILIZADO Y DEJARÁ ORDENADO Y DESINFECTADO SU PUESTO DE TRABAJO, LA MESA Y EL MATERIAL COMÚN: BALANZAS, ESTUFAS, CENTRÍFUGAS, ETC. ANTES DE ABANDONAR EL PUESTO, SE LE PEDIRÁ PERMISO AL PROFESOR PARA QUE SUPERVISE QUE TODO ESTÁ CORRECTO Y HA SIDO DESINFECTADO. ANTES DE SALIR DEL LABORATORIO ES PRECISO LAVARSE LAS MANOS CON AGUA Y JABÓN, Y ACLARARLAS CON UNA SOLUCIÓN DESINFECTANTE.

CONTENIDO DE LAS PRÁCTICAS Por motivos de organización, el orden de las mismas puede sufrir modificaciones.

Día 1.

Práctica 1. Transporte a través de membrana: Ósmosis y diálisis

Día 2.

Práctica 2. Extracción de ADN genómico. Cálculo de la concentración y la pureza

Día 3 y 4

Práctica 3. Introducción a la histología.

Día 5

Examen

PRÁCTICA 1.

TRANSPORTE A TRAVÉS DE MEMBRANAS: ÓSMOSIS Y DIÁLISIS

La membrana plasmática de las células separa el medio intracelular del medio extracelular. Las moléculas presentes en el líquido intersticial y sangre entran en contacto con la membrana celu lar. La naturaleza hidrofóbica de la membrana plasmática permite que algunas de estas moléculas sean capaces de atravesar esta membrana, mientras que otras no, dependiendo de su naturaleza química. La membrana plasmática no es permeable, por lo general, a las proteínas, ácidos nucleicos, e iones, entre otras moléculas , mientras que sí es permeable a otras moléculas pequeñas polares o hidrofóbicas. Gracias a esta discriminación en el transporte de moléculas a través de la membrana plasmática, a las proteínas transportadoras y a los canales iónicos presentes en dichas membranas , la célula va a regular la entrada y salida de determinadas moléculas; se dice, por tanto, que la membrana plasmática tiene permeabilidad selectiva. En esta práctica vamos a estudiar dos procesos distintos de transporte a través de membrana: La ósmosis, donde se estudiará, en células vivas, el paso de moléculas de agua a través de una membrana plasmática, como respuesta a cambios en la concentración de solutos en el medio extracelular. Y el fenómeno de diálisis, en el que se observará cómo una membrana semipermeable (sintética), solo permite el paso de pequeños solutos y moléculas de agua, a través de ella, impidiendo el transporte de moléculas de mayor tamaño. ÓSMOSIS 1. Fundamento Se entiende por ósmosis el paso de agua entre dos compartimentos con soluciones de diferente concentración, separados por una membrana. Los poros de la membrana son de tamaño suficiente para permitir el paso de las moléculas del disolvente (en este caso agua), pero demasiado estrechos para que pasen moléculas de soluto más grandes o iones. En el proceso de ósmosis las soluciones pueden clasificase según la cantidad de soluto que poseen, y siempre comparadas con otra, en: -

Hipertónicas: soluciones que poseen una concentración de soluto superior a otra, que se denomina… Hipotónica con respecto a la anterior, posee en consecuencia menor cantidad de soluto en disolución. Isotónicas: son las que contienen igual concentración de soluto.

Los fenómenos de ósmosis se desencadenarán por un paso de agua de la solución meno s concentrada (hipotónica) a la de mayor concentración (hipertónica). Este movimiento se mantendrá hasta que ambas soluciones igualen sus concentraciones (isotonía).

La presión osmótica es la fuerza que debe aplicarse para contrarrestar el flujo osmótico. Se puede medir mediante aparatos denominados osmómetros. La presión osmótica de una solución es independiente de la naturaleza molecular del soluto . Por ello, se podrá preparar soluciones isotónicas con el citoplasma celular, sal, sacarosa, etc. Las células tienen concentraciones bastante elevadas de solutos (sales, moléculas pequeñas), así como concentraciones menores de macromoléculas. Si las células se colocan en una disolución isotónica, no hay movimiento neto de agua en ninguna dirección a través de la membrana. Cuando las células se colocan en una disolución hipotónica se produce la entrada de agua por ósmosis (endósmosis); en soluciones hipertónicas, las células pierden agua por el proceso de exósmosis. En el caso de las células animales, estas cambian su forma y su volumen en función de la concentración de solutos del medio. Los eritrocitos, por ejemplo, son isotónicos con una disolución de NaCl al 0,9%. Cuando se colocan en una disolución hipotónica, se hinchan y se rompen por un proceso denominado hemólisis. Si los ponemos en una disolución hipertónica, se encogen por el proceso de crenación

Exosmosis

Endósmosis

Las células vegetales adultas presentan en su interior una voluminosa vacuola que se halla aislada del medio ambiente exterior por la membrana citoplasmática y la pared celular, cubierta rígida de celulosa que limita de forma efectiva los cambios de volumen de la célula, especialmente la dilatación celular. Esta cubierta, fácilmente visible al microscopio, facilita en gran medida la observación de los cambios de volumen de la vacuola y el citoplasma. En las células vegetales es la vacuola la encargada de regular la entrada y salida de agua. Cuando una célula vegetal se encuentra en un medio hipotónico la célula toma agua del medio exterior y la acumula en el interior de la vacuola; ésta, al dilatarse, oprime el citoplasma contra la pared celular por turgencia. En un ambiente hipertónico, las vacuolas se retraen, lo que induce al citoplasma y a la membrana citoplasmática a separarse de la pared esquelética. Esta retracción comienza por los ángulos de la célu la y avanza lentamente en toda la superficie. Este fenómeno se conoce con el nombre de plasmólisis.

Medio extracelular: hipertónico

Medio intracelular: hipotónico

Isotónico

Isotónico

2. Material y reactivos - Cebolla - Bisturí - Pinzas finas - Placas Petri, pequeñas - Po rtaobjetos - Pipetas Pasteur - Papel de filtro - Tampón fosfato 1 M pH 7,4 - Sol. de cloruro sódico al 4% y 6% - Rojo neutro 1% en agua - Agua destilada

Hipotónico

Hipertónico

3. Método Tinción de la vacuola 1. Se parte la cebolla longitudinalmente por la mitad, y se aísla la tercera hoja a partir de la exterior. Se corta un fragmento de 1 por 2 cm, y con la ayuda de las pinzas se aísla la capa epidérmica de la cara interna de la hoja. 2. Se sumerge inmediatamente este fragmento en una placa Petri que contenga 3 ml. de tampón fosfato 1 M, pH 7,4, y una gota de la solución de rojo neutro. Es importante trabajar rápidamente para evitar la desecación del fragmento de epidermis, lo que produciría la muerte de las células y alteraría el experi mento. 3.- Se aísla el tejido epitelial y se estira con ayuda de las agujas; en la misma placa Petri se lleva al microscopio y se observa la morfología de las vacuolas. Observación del proceso osmótico 4. A continuación, introducir con cuidado el fragmento anterior de cebolla en una placa Petri que contenga cloruro sódico al 4%. Observar al microscopio. 5. Introducir e l fragmento de cebolla en una placa Petri que contenga cloruro sódico al 6%. Observar al microscopio 6. Finalmente colocar el tejido sobre una placa Petri vacía y añadir gota a gota agua destilada mientras se observa al microscopio 7. Anotar lo observado.

4. Resultado Dibujar y explicar los cambios que sufren las células de epitelio de cebolla cuando entran en contacto con las distintas disoluciones. Solución 1 - Tampón fosfato + rojo neutro Observaciones:

Solución 2 - NaCl 4% Observaciones:

Solución 3 - NaCl 6% Observaciones:

Solución 4 - Agua destilada Observaciones:

DIÁLISIS

1. Fundamento

Las técnicas de diálisis se basan en la separación de moléculas en función de su tamaño mediante el uso de membranas con poros que permiten el paso de moléculas más pequeñas que los poros, y no el de moléculas con un tamaño superior a éstos. El paso de las moléculas pequeñas a través de los poros viene determinado por la diferencia de concentración de tales moléculas a ambos lados de la membrana y por el movimiento browniano asociado a ellas (movimiento anárquico). Cuando las moléculas chocan con la membrana de diálisis (que presenta poros de un tamaño determinado), las de diámetro o tamaño menor al de los poros de la membrana podrán atravesarla, mientras que las moléculas más grandes chocarán con la membrana y cambiarán la dirección de su movimiento. De esta forma, las moléculas pequeñas pueden separarse de las más grandes. Las moléculas pequeñas, como iones de sales y metabolitos (glucosa, aminoácidos, lactato, piruvato, etc.), pueden atravesar membranas para diálisis comunes, separándose de manera diferencial de macromoléculas tales como proteínas y ácidos nucleicos.

En el laboratorio se utilizan membranas artificiales para separar los pequeños solutos de los solutos más grandes. El celofán (acetato de celulosa) es un ejemplo dentro de los materiales porosos que permiten la separación de biomoléculas po r diálisis. El tamaño de los po ros del celofán es aproximadamente de 4-5 µm, de tal forma que no permite el paso de moléculas cuyo peso molecular sea igual o superior a 10.000 Da.

La técnica de diálisis tiene importantes aplicaciones tanto clínicas como en biología molecular. Una de ella es el uso de la diálisis como un primer paso en la purificación de proteínas. Una solución con proteínas impuras se coloca en una bolsa de diálisis de celofán y luego se suspende en un flujo de agua destilada. Tras un tiempo, todos los solutos pequeños abandonan la bolsa. La

purificación de proteínas co ntinuaría con un tratamiento posterior para eliminar las impurezas de mayor peso molecular.

Otra importante aplicación es la hemodiálisis , que consiste en la eliminación de los desechos tóxicos de la sangre en los pacientes con insuficiencia renal. Todos los constituyentes de la sangre, excepto células sanguíneas y proteínas plasmáticas, se mueven libremente entre la sangre y el líquido de diálisis. En el líquido de diálisis se incluyen nutrientes (glucosa, aminoácidos), iones (Na+, K+) y otras sustancias vitales, para evitar la pérdida de estos materiales durante la diálisis. Por el contrario, no se incluyen en el líquido de diálisis productos de desecho, como urea, ácido úrico, que pasarán de la sangre al líquido de diálisis.

2. Material y reactivos

- Membranas de diálisis - Pinzas - Micropipeta P1000 - Agua destilada - Albúmina de suero bovino (BSA) 1% en NaCl al 1% - Solución de nitrato de plata (AgNO3) - Reactivo de Bradford - Tubos eppendorf de 1,5 ml - Agitador - Imán

3. Método

1. Cortar una membrana para diálisis y dejarla en agua 24 horas. Cerrar uno de los extremos con una pinza, e introducir 3 ml de una solución de BSA al 1% en NaCl al 1%.

2. Cerrar el otro extremo e introducirlo en 500 ml de agua destilada. Mantener en agitación. Pasado un tiempo puede observarse la presencia de ión cloruro en el agua destilada mediante la adición de unas gotas de disolución de AgNO 3. Se habrá producido la separación parcial de ambas moléculas (BSA y NaCl), no total, ya que en el tubo también está en igual concentración el NaCl.

NaCl + AgNO 3 → AgCl (precipitado blanco) + NO 3Na

3. Para comprobar que las proteínas no atraviesan la membrana, en 2 eppendorf nuevos, tomaremos 800 µl de ambas soluciones (dentro y fuera de la membrana) y añadiremos 200 µl de reactivo de Bradford.

4. Resultado

PRÁCTICA 2. AISLAMIENTO DE ADN GENÓMICO

1. Fundamento El objetivo de esta práctica consiste en la familiarización con uno de los múltiples protocolos de extracción de ADN. Hoy en día, se han puesto a punto técnicas que permiten la extracción de ADN de multitud de fuentes, incluso de tejido previamente fijado y parafinado. En esta práctica, el ADN se extraerá de un tejido animal congelado. Las moléculas de ADN constituyen una doble hélice en la que las dos cadenas están unidas por puentes de hidrógeno. Cada cadena está constituida por una sucesión lineal de moléculas de desoxirribosa (una pentosa) unidas a grupos fosfato. Las moléculas de desoxirribosa, a su vez, están unidas a una base nitrogenada. Las bases nitrogenadas pueden ser de cuatro tipos: dos pirimidinas (citosina y timina) y dos purinas (adenina y guanina). La unidad básica del ADN es el nucleótido, constituido por: una molécula de desoxirribosa, un grupo fosfato y una base nitrogenada. La información genética está codificada por la secuencia de bases. Según las reglas de Watson y Crick, los puentes de hidrógeno se establecen entre adenina-timina y entre guanina-citosina, considerándose bases complementarias. Las cadenas de ADN son complementarias y antiparalelas. Los cromosomas están constituidos por largas moléculas de ADN asociadas a proteínas y se localizan en el núcleo de la célula eucariótica. En esta práctica se aislará ADN de células animales. La muestra se trata con un detergente (Nonidet p40) que provoca la desnaturalización de las proteínas y lípidos, componentes de las membranas plasmática y nuclear. La ruptura de las membranas libera los complejos de nucleoproteínas. La extracción con fenol/cloroformo/alcohol isoamílico separa los componentes de la mezcla. Se observan dos fases: una fase acuosa, donde se encuentran los ácidos nucleicos y una fase fenólica, donde aparecen los lípidos. En la interfase fenol-agua se encuentran las proteínas. Finalmente, los ácidos nucleicos se precipitan mediante la adición de etanol y una sal (en nuestro caso cloruro sódico).

AISLAMIENTO DE ADN A PARTIR DE HÍGADO DE POLLO

2. Material y reactivos

-

Hígado de pollo a -70ºc

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Mortero

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Pipeta Pasteur,

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Tubos eppendorf de 1,5 ml,

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Tubos eppendorf de 2 ml,

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Pipetas calibradas,

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Micropipetas,

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Suero fisiológico,

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Nonidet p40, NaCl 5M,

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Agua destilada,

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Fenol/Cloroformo/Isoamílico,

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Etanol absoluto, etanol 70% frío,

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TE (Tris 1mM/ EDTA 0,1 mM).

3. Método •

HOMOGENEIZADO DEL TEJIDO 1. Desmenuzar un trozo del tejido en mortero. Se añaden unas gotas de suero fisiológico y se desmenuza muy bien frotando el tejido contra las paredes del mortero 2. Se añade más suero y se recoge con una pipeta Pasteur, echándolo en un tubo eppendorf de 2 ml 3.

Se llena el tubo hasta el borde con suero fisiológi co

4.

Se centrifuga en una microfuga a 3.000 r.p.m. durante 3 min

5. Se desecha el sobrenadante con mucho cuidado y se añade otra vez suero fisiológico sobre el precipitado o pellet 6. Mezclar mediante agitación con vórtex 7. Se repite el paso 4



LISIS CELULAR 6. Se desecha el sobrenadante y se añade 700 µl de detergente Nonidet p40 0.1% 7. Mezclar el precipitado con el detergente, mediante vórtex

•

FRACCIONAMIENTO Y PURIFICACIÓN DEL ADN

8. Añadir el mismo volumen de fenol/cloroformo/alcohol isoamilíco (¡corrosivo!: quien manipule el tubo debe ponerse guantes de látex en ambas manos) 9. Mezclar bien con la mano poniendo especial cuidado en no abrir el tubo (no usar vórtex) 10. Se centrifuga en una microfuga a 12.000 r.p.m. durante 5 min 11. Pasar la fase acuosa (la superior) a un tubo limpio de 2 ml, mediante una micropipeta P200 (pasar 400 µl de fase acuosa de 100 en 100 µl). 12. Precipitar el ADN, añadiendo dos volúmenes de etanol absoluto y 80 μl de NaCl por cada 1000 μl del volumen total (96 µl de NaCl) 13. Mover cuidadosamente el tubo por inversión suave y dejar en hielo 10 min 14. Centrifugar a 12.000 rpm durante 5 min 15. Desechar el sobrenadante con cuidado y añadir 1 ml de etanol 70% frío 16. Centrifugar a 5.000 rpm durante 3 min 17. Desechar el sobrenadante con cuidado y dejar secar 18. Resuspender en 300 µl de TE (Tris /EDTA) y guardar la muestra rotulada con el número de grupo y pareja.

•

MEDIDA DE LA PUREZA Y CONCENTRACIÓN DE ADN A continuación, vamos a realizar la medida espectrofotométrica de la concentración de ADN que hemos obtenido y su grado de pureza. Para ello, nos basamos en que las bases nitrogenadas absorben en el espectro de luz UV a 260 nm y las proteínas debido a la existencia de aminoácidos aromáticos lo hacen a 280 nm. 1. Tomamos un volumen de 100 µl de la muestra de ADN obtenida y añadimos 1900 µl de agua destilada en un nuevo tubo eppendorf

de 2 ml. Dicha dilución la introducimos en una cubeta de espectrofotómetro, y medimos la absorbancia a longitudes de onda de 260 nm y de 280 nm. 2.

Calculamos el grado de pureza: Se trata de un índice y no tiene unidades. Para su cálculo se tienen en cuenta los valores de absorbancia debido a ADN y proteínas ( A260 y A280)

Grado de Pureza =

𝑀𝑒𝑑𝑖𝑑𝑎 𝑎 260 𝑛𝑚 𝑀𝑒𝑑𝑖𝑑𝑎 𝑎 280 𝑛𝑚

El grado de pureza debe estar entre 1,6-2,0 (pureza óptima=1,8) 3. Cálculo de la concentración de ADN: Se establece que 1 unidad de densidad óptica (1 unidad de absorbancia en nuestro caso) equivale a 50 µg/ml de ADN. Así pues, para el cálculo de la concentración de ADN sólo ha de tenerse en cuenta el valor correspondiente a la ab...