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UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS (Universidad del Perú, DECANA DE AMÉRICA) FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA ESCUELA PROFESIONAL DE CIENCIA DE LOS ALIMENTOS

I NFORME N°10:

HI DRÓLI SI SENZI MÁTI CA DE LA LACTOSA EN LA LECHE

ALUMNA: - Orlandini Mendoza, Claudia Melissa

DOCENTE: - Ing. Vega Paulino Roberto

DOCENTE COLABORADOR: - Mg. Pamela Canales

CURSO: - Bioquímica de los alimentos

2017–I I HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DE LA LACTOSA EN LA LECHE

I.

INTRODUCCIÓN El principal carbohidrato o azúcar que encontramos en la leche es la lactosa, este químicamente es un disacárido conformado por glucosa y galactosa mediante un enlace glucosídico, forma parte de los glúcidos de tipo absorbibles y se encuentra en la leche en una concentración aproximada al 5%. 1 Este disacárido es hidrolizado en glucosa y galactosa por la enzima lactasa que se encuentra en la mucosa intestinal hasta el período posnatal ya que con la edad perdemos la actividad de esta enzima, otro factor que influye en la perdida de la actividad de la lactasa es un daño mucoso intestinal y en ocasiones por un déficit congénito.2 Las consecuencias que conllevan la nula absorción de lactosa son los trastornos gastrointestinales en el aspecto de salud humana sin embargo también existen problemas con este disacárido en el aspecto tecnológico ya que la lactosa es fácilmente cristalizable y poco soluble lo que es un problema en la industria láctea y hasta puede ser causante de contaminación ambiental debido a que compone el suero de leche que es vertido por industrias que elaboran queso a los ríos sin tomar en cuenta que la lactosa no es fácilmente biodegradable. Por ello se desarrollan tecnologías donde usan enzimas como lactasas libres o inmovilizadas en reactores de flujo pistón o de tanque agitado para degradar a la lactosa de la leche y/o productos lácteos para evitar problemas de salud mencionados anteriormente como tecnológicos y ambientales.1

II.

OBJETIVOS 1. Analizar la actividad enzimática de la lactasa en leche entera, leche deslactosada y solución de lactosa. 2. Cuantificar la concentración de glucosa en leche entera, leche deslactosada y solución de lactosa por el método espectrofotométrico usando un kit enzimático para reconocer glucosa.

III.

METODOLOGÍA

1. Preparar una batería de soluciones y rotular con A, B, C y D. A: Solución de lactosa al 5%. Pesar 2.5 g de lactosa y añadir a una fiola de 50 ml para enrazar con agua destilada hasta el aforo.

Fig. 1: Solución de lactosa al 5%

B: Colocar en un tubo de ensayo 100 ul de la solución A. C: Leche GLORIA UHT Entera Bolsa Medir 50 ml de leche entera en un matraz. D: Leche GLORIA UHT Sin lactosa Bolsa Medir en un matraz 50 ml de leche deslactosada. B

A

Fig. 2: A: Muestra de Leche GLORIA UHT Entera Bolsa, B: Leche GLORIA UHT Sin lactosa Bolsa.

2. Medir la concentración de glucosa inicial. 2.1 Coger 10 ul de muestra (A, C y D) y colocar en tubos por separado rotulados respectivamente. Además añadir 1 ml del kit enzimático a un tubo para que sirva como blanco. 2.2 Añadir a cada tubo (A, C y D) 1 ml del kit enzimático, excepto al blanco. 2.3 Colocar los 4 tubos (A, C, D y Blanco) a incubar a 37°C por 5 minutos. 2.4 Luego, leer al espectrofotómetro a una longitud de onda de 505 nm y hallar la absorbancia de cada tubo (A, C y D), blanqueando previamente con el tubo preparado como blanco.

3. Añadir 20 ul de lactasa a los tubos (A, C y D), mover e incubar a temperatura ambiente por 10 minutos. 4. Medir la concentración de glucosa final. 4.1 Coger 10 ul de muestra (A, B, C y D) y colocar en tubos por separado rotulados respectivamente. Fig. 3: Tubos con muestra A, B, C y D.

4.2 Añadir a cada tubo (A, B, C y D) 1 ml del kit enzimático. 4.3 Colocar los 5 tubos (A, B, C, D) a incubar a 37°C por 5 minutos. Fig. 4: Muestras A, B, C y D con el kit enzimático incubando.

4.4 Luego, leer al espectrofotómetro a una longitud de onda de 505 nm y hallar la absorbancia de cada tubo (A, B, C y D). 5. Determinar la concentración de glucosa producida según los valores de absorbancia obtenidos empleando la fórmula que se presenta a continuación.

IV.

RESULTADOS

Medición de la concentración de glucosa: Se halló las absorbancias de las muestras (Tabla 1) por el método espectrofotométrico, en la tabla 1 se observa que la muestra D (leche deslactosada) presenta la absorbancia mayor esto quiere decir que se ha reconocido mayor concentración de glucosa que en las otras, sin embargo no se puede considerar esta absorbancia ya que la coloración de la muestra era muy intensa y esto que se describe es una limitación de la ley de Lambert y Beer por ello se debe diluir. Además podemos apreciar que tanto la leche entera como la leche deslactosada presentan glucosa en su composición, claramente en la deslactosada es mucho mayor. Tabla 1: Absorbancias de las muestras antes de añadir la enzima lactasa Muestra Blanco Muestra A Muestra C Muestra D

Absorbancias 0 0 1.057 4.031

*Blanco: Kit enzimático Muestra A: Solución de lactosa al 5% Muestra C: Leche GLORIA UHT Entera Bolsa Muestra D: Leche GLORIA UHT Sin lactosa Bolsa

Se halló las absorbancias (Tabla 3) por el método espectrofotométrico, se evidencio concentración de glucosa en la leche entera (Muestra C), en las muestras de solución de lactosa (Muestra A y B) y en la leche deslactosada (Muestra D). En esta última se diluyo 1:10 y se procedió a leer en el espectrofotómetro por eso es que la concentración de glucosa es menor. Tabla 2: Absorbancias de las muestras después de añadir la enzima lactasa Muestra Muestra A Muestra B Muestra C Muestra D

Absorbancias 0.007 0.007 1.547 0.53

*Blanco: Kit enzimático Muestra A: Solución de lactosa al 5% Muestra B: Solución de lactosa al 5% Muestra C: Leche GLORIA UHT Entera Bolsa Muestra D: Leche GLORIA UHT Sin lactosa Bolsa

En la siguiente tabla 3 se observa las concentraciones de glucosas en las muestras antes y después de añadir la enzima lactasa, se evidencia la actividad enzimática de la lactasa en la solución de lactosa (Muestra A y B) llegando a obtenerse 1.9887 mg de glucosa por dL de solución a partir de una muestra pura de lactosa, en la leche entera se obtuvo mayor concentración de glucosa de 300.2937 mg/dL a 439.5027 mg/dL ya que la leche contiene lactosa que fue hidrolizada en galactosa y glucosa por la enzima lactasa, de esta forma aumenta la concentración de glucosa y finalmente en el caso de la leche deslactosada se llegó a obtener una mayor concentración de glucosa tras añadirle la enzima esto debido a una cierta cantidad

de lactosa en la leche deslactosada que fue hidrolizada y por ello aumento en la concentración. Además en la muestra D (leche deslactosada) se llevó a cabo una dilución de 1:10 siendo el factor de dilución 10 como se menciona posteriormente y con lo que se realizaron los cálculos. Tabla 3: Concentración de glucosa de las muestras Sin lactasa Concentración de Muestra glucosa Muestra A 0 mg/dL Muestra B - mg/dL Muestra C 300.2937 mg/dL Muestra D 1145.2071 mg/dL

Con lactasa Concentración de Muestra glucosa Muestra A 1.9887 mg/dL Muestra B 1.9887 mg/dL Muestra C Muestra D

439.5027 mg/dL 150.573 mg/dL (10) =1505.73 mg/dL

*Blanco: Kit enzimático Muestra A: Solución de lactosa al 5% Muestra B: Solución de lactosa al 5% Muestra C: Leche GLORIA UHT Entera Bolsa Muestra D: Leche GLORIA UHT Sin lactosa Bolsa F.D: Factor de dilución: 10

V.

DISCUSIONES De acuerdo con Biocon Española S.A., la lactasa procedente de la levadura Kluyveromyces L. lleva a cabo su actividad en el pH natural de la leche (6.7) y tiene una temperatura máxima de actividad hasta los 45°C. Para que la lactosa se hidrolice de forma más rápida se debe trabajar con alta temperatura y la dosis de la enzima por litro de leche se debe aumentar también, pero por razón de conservación de la leche se opta por trabajar a baja temperatura o a temperatura ambiente. En nuestro caso usamos una enzima (lactasa) comercial para hidrolizar a la lactosa de nuestras muestras y se la dejo actuar a temperatura ambiente por un lapso de 10 minutos.3 Existen 2 tratamientos al que se le somete a la leche para eliminar la lactosa presente y obtener un producto deslactosado, el primero se llama Tratamiento batch (antes de la esterilización por UHT), este tratamiento se basa en añadir la enzima a la leche pasteurizada manteniéndose una temperatura baja (8°C-10°C) con cierta dosis en mililitros por litro de leche y en un tiempo necesario para lograr el grado de hidrolisis de lactosa deseado. Por ejemplo para este tratamiento se debe esperar un tiempo de 48 horas la enzima con la leche para poder obtener una hidrolisis del 100% de lactosa, en nuestro caso tan solo se dejó incubando a temperatura ambiente a la leche entera y solución de lactosa con la enzima un lapso de 10 min, lo que evidenciaría que en ambas muestras no se haya llegado a hidrolizar el 100% de la lactosa y las concentraciones de glucosa de 1.9887 mg de glucosa /dL y 439.5027 mg de glucosa /dL respectivamente no sean las finales.3 Esta empresa Biocon Española S.A menciona que a la leche deslactosada se le realiza un control de grado de lactosa residual mediante HPLC (Cromatografía liquida de alta resolución) y esta se encuentra normalmente inferior al 0.1%. Considerando esto podemos explicar el porqué del aumento en la concentración de glucosa que ocurrió en la leche deslactosada suponiéndose que no había lactosa

VI.

por hidrolizar ya que previamente fue procesada, sin embargo existe una cantidad residual de lactosa que fue sustrato de la enzima lactasa y por ello pudo aumentar la concentración de glucosa de 1145.2071 mg de glucosa /dL a 1505.73 mg de glucosa /dL.3 CONCLUSIONES 1. Se analizó la actividad enzimática de la enzima lactasa en leche entera, leche deslactosada y solución de lactosa ya que la concentración de glucosa aumento y esto se explica porque la lactasa en presencia de lactosa la hidroliza desdoblándola en galactosa y glucosa. 2. Haciendo uso de un kit enzimático para reconocer glucosa y por medio de espectrofotometría se pudo cuantificar la concentración de glucosa en leche entera, leche deslactosada y solución de lactosa tanto antes de añadir lactasa como después, obteniéndose un amento de concentración en la solución de lactosa (0 mg de glucosa/dL(sin lactasa) - 1.9887 mg de glucosa/dL (con lactasa)), en la leche entera (300.2937 mg de glucosa/dL(sin lactasa) - 439.5027 mg de glucosa/dL (con lactasa)) y finalmente en la leche deslactosada que presentaba lactosa residual y fue hidrolizada (1145.2071 mg de glucosa/dL(sin lactasa) - 1505.73 mg de glucosa/dL (con lactasa)).

VII.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 1. Cardona C, Álvarez C, Jaramillo J. Optimización de la hidrólisis enzimática de lactosa en reactores de tanque agitado. Vector. 2010; 5: 115-121. 2. La Orden E, Carabaño I, Pelayo F. Situación actual de la intolerancia a la lactosa en la infancia. Rev Pediatr Aten Prim. 2011; 13 (50): 271-278. 3. Biocon Española S.A. Producción y control de leche deslactosada....