Histoquimica de los lípidos PDF

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Tecnicas como Sudan black o sudan III...

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Histoquimica de los lípidos Los lípidos usualmente se pierden en procedimientos histológicos de rutina, los fijadores y los pasos por alcoholes suelen disolver a los lípidos, haciendo que ópticamente sean visibles como vacuolas o espacios vacíos. Los lípidos son grupos de sustancias heterogéneas que sólo tienen en común el hecho de ser insolubles en agua (hidrófobas), y que son solubles en disolventes orgánicos no polares como el éter, cloroformo. Benceno, etc. Su principal propiedad biológica es la hidrofobicidad. La baja solubilidad de los lípidos se debe a que su estructura química es fundamentalmente hidrocarbonada (alifática, alicíclica o aromatica), con gran cantidad de enlaces de C-H y C-C. Cabe destacar que, en los lípidos, se generan enlaces covalentes. Para poder fijar a estos lípidos se recomienda el uso de la congelación, siendo éste el mejor método empleado ya que algunos lípidos como los fosfolípidos, lipofuscina, y gránulos de leucocitos pueden unirse a otros elementos del tejido y resistir el procesamiento en parafina. Otro método es mediante fijadores químicos, éstos últimos deben cumplir con el requisito de evitar la oxidación o “enranciamiento” bloqueando enlaces -CH=CH-, ya que implica deterioro de los lípidos de la muestra. Uno de los fijadores empleados es el tetróxido de osmio, ideal para microscopia electrónica, ya que se fija en los dobles enlaces de las cadenas laterales de los lípidos de las membranas plasmáticas, y además el Os es un metal opaco a los electrones (sirve de tinción). Clasificación de los lípidos o       o 

Hidrofóbicos Ácidos Grasos: Insolubles con cationes de calcio y otros metales. Existen saturados como el ácido palmítico, y otros insaturados como oleico y linoleico. Terpenos: en sebo y precursores de colesterol Esteroides: colesterol y hormonas. Son difíciles de identificar. Grasas Neutras: monoglicéridos, diglicéridos y triglicéridos. Ceras Ésteres de Colesterol Hidrofílicos Fosfoglicéridos: grupos polares como el éster fosfato, hidroxilos y amonio cuaternario. Las lecitinas son producidas por el hígado, cefalinas en cerebro y coagulación. Los plasmalógenos en fibras mielínicas y cerebro.

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Esfingomielina: derivado de la esfingosina en el encéfalo y tejido nervioso. Por hidrólisis de las esfingomielinas se obtiene un ácido graso, ácido fosfórico colina y un amino alcohol complejo. Ceramidas: esfingosina que no posee grupos fosfato, y se encuentran en escasa cantidad.

Como el tetroxido de osmio no es muy común para usar en servicios de anatomía patológica, se puede emplear formol tamponado al 10%, o fijadores con iones de calcio como Baker para conservar fosfolípidos hidrofílicos. Se deja de 2 a 3 días aproximadamente para proseguir a incluir, en caso de hacer una congelación se realiza en 1 hora para tejido fresco en el criostato. Hay que considerar que una fijación prolongada interfiere en la tinción de fosfoglicéridos. EL calcio actuaría tamponando la formalina, puesto que el ácido fórmico podría solubilizar lípidos. Además, los iones calcio tendrían un efecto saponificador de los ácidos grasos libres, formando jabones insolubles en acetona. El formol-calcio es el fijador de elección para histoquímica de lípidos los lípidos no son verdaderamente fijados por la formalina, pero los lípidos son retenidos indirectamente por estabilización de proteínas y la formación de puentes cruzados. Como la membrana y mielina poseen fosfolípidos, se debe utilizar formol calcio para conservarlos, debido a su propiedad anfipática (parte polar y apolar), por 6 a 24 horas dependiendo de la técnica a usar posteriormente, haciendo que el calcio forme micelas para conservar los componentes. Una desventaja, es que forman fosfatos de calcio, el cual precipita en altas temperaturas sobre la muestra, para evitar esto es importante que la formalina esté a pH 7.

Coloración de Lípidos Para esto se usan sustancias coloreadas no polares solubles en los lípidos, no son colorantes propiamente tal, por lo que se le denominó lisocromos, los cuales son capaces de teñir porque son más solubles en lípidos que en el solvente utilizado, pero no poseen auxocromos. Dichos lisocromos son el Sudán III, Sudán IV, Sudán Black y Red Oil. Los requisitos que deben cumplir estos lisocromos, primero que todo, es que debe ser suficientemente coloreado para la muestra, soluble en lípidos, desprovistos de afinidad por otros constituyentes celulares, el solvente utilizado para el lisocromo no debe extraer lípidos y deben ser parcialmente solubles en el solvente. Lo que se va a detectar en su mayoría son grasas neutras, como en las patologías hepaticas y vesiculares. Estas grasas neutras son apolares hidrófobas, son muy estables y podemos identificarlas sin necesidad de fijación. Como ya se mencionó, los lisocromos po poseen grupos auxocromos, si no que tiñen a los lípidos al disolverse en ellos, en vez de realizar uniones químicas como acostumbramos. Tiene grupos Axoicos como cromóforos y tienen grupos OH en posición orto en relación con el grupo azo.

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Sudán Black

Posee grupo azoico, y dos grupos amino secundarios en 1.8. Colorea azul con negro los lípidos, es un método fácil, y además permite la tinción de lípidos con cortes de parafina. Para emplear este lisocromo, se realizan cortes en congelación, se fijan y luego se sumergen en soluciones alcohólicas bajas saturadas con la tinción. La técnica se realiza con cortes en flotación. La solución es inestable, tiene poca duración (una semana) y se debe usar en el momento en que se preparó. Se utiliza para demostrar triglicéridos, esteres de colesterol, cerebroosidosis, etc.

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Oil Red

Este lisocromo de la familia de los azoicos se utiliza para demostrar trigicleridos en cortes congelados. Aunque es usualmente reemplazado por Sudán III y Sudán IV, debido a que colorean de un color rojo más intenso los lípidos. A modo de repaso, cabe recordar la esteatosis hepática, debido a su acumulación anormal de grasas en forma de triglicéridos en el citoplasma de células parenquimatosas como por ejemplo hepatocitos. Se reconocen dos tipos de esteatosis: esteatosis microvacuolar y esteatosis macrovacuolar. En la primera se trata habitualmente de un daño celular agudo, en el que las células aparecen al microscopio de luz con múltiples vacuolas pequeñas intracitoplasmáticas sin desplazamiento del núcleo y que son positivas con tinciones para grasas; en la segunda, que traduce un daño crónico, el citoplasma está ocupado por una sola gran vacuola, que desplaza y rechaza el citoplasma y el núcleo hacia la periferia. Corte por congelación de hígado teñido con Sudan IV, colorante liposoluble, tiñe de rojo las grasas neutras, en forma de gotas pequeñas y medianas. 500x.

Para montar se emplea un medio hidrófilo como el hydromount, ya que se debe evitar pasos por xilol y alcohol.

Método de tetróxido de Osmio El tetróxido es un agente de tinción ampliamente usado en microscopía electrónica de transmisión para proveer contraste a la imagen. En la tinción de la membrana plasmática, el tetróxido de osmio enlaza regiones de cabeza de fosfolípidos, creando así contraste con el citoplasma vecino. Si bien el tetróxido en conjunto al bicloruro de mercurio puede fijar muestras biológicas, en este protocolo se utiliza fijación con formol calcio, y se usa el tetróxido como coloreante, ya que éste reacciona con los lípidos a nivel de sus enlaces insaturados, resultado una vaina de mielina teñida de negro por su alto contenido de lípidos insaturados. En la muestra presente en la fotografía, se tienen lípidos en células hepáticas. Fueron teñidas con tetróxido de Osmio y con contraste nuclear con safranina (número 2). En los lípidos insaturados la reacción del tetróxido de osmio produce una oxidación de los puentes -CH-CH. éste es soluble para lípidos hidrofílicos e hidrofóbicos. Para poder diferenciar entre lípidos se agrega cloruro de potasio, el cual es un agente oxidante que se disuelve en líquidos polares permitiendo diferenciarlos. Método de conservación Para conservar los lípidos se emplea la cromación, ya que los fosfolípidos se tornan insolubles en solventes orgánicos por tratamiento prolongado con dicromato de K o con algunos iones metálicos. Esto producirá una reacción con los dobles enlaces o con grupos funcionales como los hidroxilos.

Colesterol Los ésteres del colesterol se distinguen del resto de los lípidos porque con luz polarizada producen las llamadas Cruces de Malta. El colesterol (o colesterina) aislado es extracelular, se presenta en forma de cristales aciculares, no rara vez rodeados o englobados por celulares gigantes de reacción a cuerpo extraño.

Corte por congelación teñido con Sudan IV por 20 minutos a 60 grados Celsius: esferocristales con cruces de Malta. Preparación observada con luz polarizada. 200x...