Il DNA ricombinante e la produzione dell\'insulina umana (Lezione di biotecnologia) PDF

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Lezione sul DNA ricombinante e sulla produzione dell'insulina umana attraverso metodi di ricombinazione genetica. Ottimi appunti per comprendere l'argomento e per approfondimento delle nozioni già acquisite....

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Biologia

DNA ricombinante Il DNA ricombinante è un frammento di DNA ottenuto in laboratorio dall'unione di almeno 2 componenti e una partizione di DNA ottenuta con metodi di ricombinazione genetica. In questo modo vengono combinati materiali genetici provenienti da differenti organismi sfruttando il fatto che le molecole di DNA in tutti gli organismi hanno la stessa struttura chimica, variando solo la sequenza nucleotidica. CREAZIONE DEL DNA RICOMBINANTE Il DNA ricombinante viene ottenuto attraverso la tecnica del clonaggio. Tale tecnica consiste nell'inserire un frammento del DNA in un vettore (DNA ricombinante) e introdurre questo prodotto in una cellula ospite. Il clonaggio può essere schematizzato nelle seguenti fasi: ● ●

Preparazione del terreno di coltura e delle piastre di crescita; Preparazione del DNA da clonare: Purificazione; creazione delle estremità coesive (Sticky

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ends); Inserzione del DNA da clonare in un vettore;

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Inserzione del vettore nell'ospite, TRASFORMAZIONE; Piastramento delle cellule;

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Crescita; Recupero dei CLONI;

Tra i vettori utilizzati nel clonaggio e la tecnica del DNA ricombinante abbiamo: ● ●

Plasmidi, che contiene fino a 20 coppie di basi; Virus;

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Cosmidi, contiene fino a 50 coppie di basi; Cromosomi artificiali.

I VETTORI VIRUS ANIMALI I vettori virus animali consentono il trasferimento di geni nelle cellule batteriche. Per introdurre DNA esogeno nelle cellule superiori si adottano come vettori i virus animali in grado di infettare cellule in vitro o in vivo per replicarsi e in alcuni casi di integrarsi nel genoma.

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Papovirus scimmia, Papillomavirus bovino, virus herpes, possono infettare e in alcuni casi trasformare una varietà di linee cellulari. Efficienza di introdurre il proprio DNA nella cellula ospite. Per inserire il DNA nel vettore si utilizzano le endonucleasi di restrizione, le quali sono in grado di riconoscere delle sequenze di DNA e tagliare il DNA in punti specifici. Quindi nella fase di ligazione i frammenti di DNA appaiati vengono saldati tra loro dall'enzima ligasi, che catalizza la formazione di legami fosfodiesterici (legame che svolge un ruolo essenziale nel determinare la struttura degli acidi nucleici). PLASMIDI I plasmidi sono molecole di DNA circolare a doppio filamento che esistono nei batteri e nei nuclei di alcune cellule procariotiche. Sono in grado di replicarsi indipendentemente dalla cellula ospite e la loro dimensione varia da poche kB a circa 100 kB. Il plasmide e il DNA da inserire vengono trattati con lo stesso enzima, così da presentare estremità appiccicose e compatibili. Si ha poi l'appaiamento delle estremità complementari e, tramite l'intervento della DNA ligasi, l'unione dei frammenti. TIPOLOGIE DI PLASMIDI Vi sono plasmidi ad elevato numero di copie e plasmidi a basso numero di copie. La replicazione dei plasmidi ad elevato numero di copie avviene più frequentemente rispetto a quella del DNA cromosomico. La replicazione dei plasmidi a basso numero di copie avviene con la stessa frequenza del DNA cromosomico. I plasmidi possono essere classificati anche in base alla specificità d'ospite. Si dicono a specificità d'ospite limitata quei plasmidi che sono in grado di replicarsi in un numero limitato di specie batteriche e (per esempio PBR322 e PUC18 si replicano solo in E.coli). Si dicono a largo spettro d'ospite quei plasmidi che sono in grado di replicarsi in una vasta gamma di specie batteriche. Questi plasmidi possiedono geni per il riconoscimento dell'origine di replicazione e dipendono meno dall’apparato replicativo dell'ospite batterico. Requisiti di un plasmide per il clonaggio sono: ●

Piccole dimensioni per aumentare l'efficienza della trasformazione;

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Presenza dell'origine di replicazione (ORI); Presenza di un buon numero di siti di restrizione unici (polylinker)

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L'INSULINA UMANA PRODOTTA DAI BATTERI L'insulina umana è stata una delle prime proteine ad essere prodotte con la tecnica del DNA ricombinante. Lo si ottenne inserendo il gene umano in alcuni organismi unicellulari, gli Escherichia Coli (batteri GRAM negativi), e ottenendo così grandi quantità di insulina perfettamente identica a quella prodotta dagli esseri umani. L'introduzione sul mercato di questo farmaco ha sicuramente costituito un notevole miglioramento delle aspettative di vita di tutti i diabetici. Venne realizzata per la prima volta nel 1977 dagli scienziati statunitensi Herbert Boyer e Stanley Cohen. La sua commercializzazione avvenne a partire dal 1982 con il nome HUMULIN dalla casa farmaceutica "Eli Lilly and company" in collaborazione con la Genentech fondata dallo stesso Herbert Boyer. Fu il primo brevetto depositato per un farmaco ottenuto con le tecniche dell'ingegneria genetica e approvato dalla U.S. Food and Drug Administration. LE TAPPE DELLA PRODUZIONE DELL'INSULINA UMANA ●

Il frammento del DNA che corrisponde al gene umano dell'insulina viene isolato attraverso diverse tecniche. La più efficace è rapida è quella che prevede la creazione del gene a partire dall'RNA messaggero, che si trova in grande abbondanza nelle veloce beta del pancreas di persone non affette dal diabete. La molecola DI RNA messaggero costituisce una copia complementare del DNA che forma il gene dell'insulina. Con l'utilizzo di un enzima detto trascrittasi inversa (estratto da alcun virus) viene creata la copia di DNA complementare all'RNA messaggero. Si ottiene però solo un singolo filamento (mentre il DNA è costituito da una doppia elica o doppio filamento), quindi si inserisce un altro enzima detto DNA-polimerasi che crea il filamento complementare del DNA che corrisponde al gene completo dell'insulina umana.

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Il vettore usato per inserire il gene nel batterio è un plasmide (piccolo anello di DNA presente nei batteri). Questo plasmide ad anello viene tagliato da un enzima detto endonucleasi di restrizione e mescolato con il DNA del gene. L'intervento di un altro enzima, il DNA-ligasi, permette l'unione tra il DNA plasmidico e quello del gene

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dell'insulina. Il plasmide si ricompone ad anello comprendendo anche il gene nuovo. Il plasmide messo a contatto con la cellula di Escherichia coli penetra al suo interno. Il DNA ricombinante diventa parte integrante del DNA del batterio, il quale inizia a riprodursi generando tante cellule identiche, tutte in grado di produrre l'insulina umana.

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Il numero dei batteri inseriti in appositi fermentatori aumenta in modo esponenziale, producendo molta insulina che viene estratta, purificata e confezionata.

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Con questa stessa tecnica vengono prodotte molte altre proteine, come l'ormone della crescita (precedentemente estratto dai cadaveri umani), l'interferone (usato nella terapia dell'epatite C) o alcuni vaccini di ultima generazione come quello dell'epatite B.

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