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Informe microsocopia 3 laboratorio biología celular...

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Facultad de Ciencias de la Vida Departamento de Ciencias Biológicas

Informe de Laboratorio 3 “Microscopía II’’

Integrantes: -Sofía Sáez -Maximiliano Schorwer

Docentes: -Natalia Avilés -Francisco Valdebenito

Facultad de Ciencias de la Vida Departamento de Ciencias Biológicas

Introducción. El microscopio lleva cientos de años utilizándose como instrumento para la exploración de nuevos mundos. Janssen, Leeuwenhoek, Hooke, Drebbel, entre otros, son los responsables del avance y creación de este instrumento, el cual fue marcando logros en el conocimiento de organismos vivos, la comprensión de su morfología, estructuras constituyentes y comportamiento, aspectos que hasta entonces eran desconocidos (1). El microscopio surgió de la necesidad de observar objetos no perceptibles por el ojo humano. Este instrumento permite visualizar con claridad objetos extremadamente pequeños. Generalmente esto se logra mediante un sistema óptico compuesto de lentes que dan forma y amplifican la imagen de lo que se observa. Sus aportes han sido fundamentales para el estudio de las diversas áreas de la ciencia, como en la química, microbiología, histología y medicina entre otras. Existen diversos tipos de microscopios, de los cuales el más popular, es el microscopio óptico, el cual está conformado por 3 sistemas y tiene como base de funcionamiento una combinación de lentes que permiten la existencia de los poderes de aumento, de penetración, de definición y de resolución, pudiendo así visualizar una imagen aumentada, definida e invertida (2). La creación de distintos tipos de microscopios fue movida por la necesidad de individualizar sus usos y características, por lo que existen clasificaciones según el número de lentes y oculares, transmisión de luz y según su fuente de iluminación, donde podemos encontrar los de campo claro y oscuro. El microscopio es un equipo que pasó a ser casi una norma dentro de un laboratorio, cuyas posibilidades de adaptación a los deseos del usuario abarcan toda una gama de posibilidades de aplicación, desde los más sencillos análisis hasta los más complicados trabajos científicos (3). A partir de conocimientos previos y su profundización, se utilizaron microscopios de campo claro y de campo oscuro. El de campo claro (microscopio de luz) es una de las formas de microscopía más simple y es utilizado comúnmente en patología para observar tejidos con tinción, como por ejemplo el frotis de sangre. En este, el espécimen a visualizar es iluminado desde su parte inferior y observado desde la parte superior, viéndose brillante, pero no tanto como lo es el fondo, por lo tanto se puede observar con claridad la muestra (4). El microscopio de campo oscuro, en cambio, está compuesto por un microscopio óptico convencional, al cual se le acondiciona un condensador especial cuyo fin es generar y enviar rayos de luz con una forma cónica por un lateral y de esta forma no penetrar directamente los rayos de luz sobre la muestra (5). Se realizó el conteo y cálculo de tamaño promedio de distintos tipos celulares utilizando la cámara de Neubauer. Esta es cámara es una placa de cristal gruesa, cuya forma es similar a la de un portaobjetos y suele medir unos 30x70mm con 4 mm de grosor, la que incluye una reglilla con 100 divisiones la cual facilita la obtención de tamaños de las distintas células (6). Hipótesis: El microscopio, además de permitir ver muestras en un cierto aumento, permite calcular el tamaño promedio de las células y la cantidad de estas por un volumen de líquido establecido. Objetivos: 1) Distinguir las diferencias al observar muestras frescas de cabello mediante la utilización de un microscopio de campo claro y uno de campo oscuro. 2) Calcular correctamente el tamaño promedio de distintos tipos celulares (GR y GB) con la cámara de Neubauer y la reglilla. 3) Reconocer la importancia de la dilución con solución buffer, previa a la observación de la muestra.

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Materiales y métodos Actividad n°1: Procedimientos y observaciones de muestras frescas (cabello). La actividad se realizó a partir de dos imágenes (una campo claro y otra campo oscuro), las cuales fueron otorgadas por parte de los profesores (pauta de resultados) y correspondían a una muestra fresca de cabello. La actividad consistió en observar la muestra a través de un microscopio de campo oscuro y de campo claro, para poder visualizar las diferencias entre estos 2 métodos y comentar las características observadas en las dos imágenes. El aumento fue igual para ambas observaciones (400X). Actividad n°2: Determinar el tamaño celular promedio de un GR y un GB en un frotis sanguíneo. La actividad consistió en el cálculo promedio del tamaño de diez glóbulos rojos y de un glóbulo blanco, los cuales estaban presentes en una imagen de muestra de frotis de sangre permanente (con tinción), la cual fue proporcionada por los profesores. Para lograr aquello se observó la muestra con un aumento de 40X y se ocupó un patrón de calibración (reglilla de 100 divisiones) correspondiente a ese lente objetivo. Para calcular el tamaño promedio de los GR se procedió a escoger 10 de estos y de los GB solo se escogió uno, ya que era el único que se logró visualizar. Se calculó el promedio, el promedio obtenido se convirtió en milímetros (100 rayas = 0,25 milímetros) y se realizó una conversión de unidades para que el resultado quede en micrómetros (µm). Actividad n°3: Determinación del número de células. La actividad de realizó gracias a la imagen de una suspensión de eritrocitos con un factor de dilución de 1/100 observada con un aumento de 40X y con un video explicativo realizado por uno de nuestros profesores. El fin de esta actividad fue colocar en práctica los conocimientos otorgados sobre el recuento Celular de la Cámara de Neubauer , lo que permitió determinar el número de células en 1 ml de líquido. Para determinar el número de células en la muestra de eritrocitos, primero se debió colocar el cubreobjeto sobre la cámara y colocar una gota para que penetrara el espacio por capilaridad. Luego de esperar un tiempo se procedió a colocar la cámara sobre la platina y se procuró hacer la observación de manera rápida, ya que mientras más tiempo pase uno observando la muestra, más rápido la luz evapora el líquido. Las células se contaron de acuerdo al límite rojo establecido en la guía y bajo las fórmulas establecidas para dicho cálculo (X=[(a*250):n] * Fd).

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Resultados A. Campo Oscuro Procedimientos y observaciones de muestras frescas Observe las siguientes figuras y anote 3 observaciones de cada una de ellas. Observación de muestra temporal de cabello humano en microscopio convencional de campo claro. Dibujo N° 1 Tipo de muestra: Temporal Tinción: Sin tinción Aumento del objetivo: 40 X Aumento total: 400 X Observaciones: 1) Los contornos del cabello se ven definidos y con un color más oscuro al del centro. 2) Se logra apreciar en la muestra un cabello de color café. 3) El color del cabello permanece constante y uniforme en casi su totalidad. 4) El fondo de la muestra es de un celeste pastel. © Víctor M. Holguín

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Observación de muestra temporal de cabello humano en microscopio de campo oscuro adaptado, usando un círculo de cartón negro.

Dibujo N° 2 Tipo de muestra: Temporal Tinción: Sin tinción Aumento del objetivo: 40X Aumento total: 400X Observaciones: 1) El fondo en el que está inmerso la muestra de cabello es de un azul claro y se presenta de manera uniforme. 2) Al ser observada con un microscopio de campo oscuro le da una apariencia 3D. 3) Los límites del cabello están definidos (café oscuro) y el centro se ve de un color brillante.. © shutterstock.com

¿Cuál es la diferencia en la observación con el microscopio de campo claro y el de campo oscuro? ¿Cuál es el efecto obtenido? La diferencia al observar una muestra en un campo claro y observar la misma muestra en un campo oscuro, es que la muestra observada en campo claro a pesar de que se logró observar con simpleza, no se observaron tantos detalles como los observados con el microscopio de campo oscuro, los cuales dieron una apariencia más 3D según nuestro criterio a la muestra de “cabello”. Además, el color del fondo de la muestra de campo oscuro se ve uniforme, con destellos blancos alrededor del cabello, en cambio en la muestra con campo claro se observa un fondo con más matices de colores. Se observa un efecto de mayor nitidez y claridad en la imagen formada por el microscopio de campo oscuro en comparación a la obtenida por el microscopio de campo claro.

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B. Reglilla Determine el tamaño celular promedio de un glóbulo rojo y de un glóbulo blanco en un frotis sanguíneo permanente. Esta imagen se está observando en objetivo de 40X.

© and.tapia-CDB-FCsV Utilice la siguiente tabla de conversión de medidas para informar el tamaño de los glóbulos en micrómetro (µm). Objetivo

Distancia en Ocular

4X 10X 40X

4 rayas 10 rayas 10 rayas

Distancia en Patrón conocido 1 mm 1 mm 0,25 mm

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

●

Tamaño promedio glóbulo rojo:

Tamaño promedio glóbulo blanco:

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C. Determinación del número de células

A partir de una suspensión de eritrocitos, determine el número de células por µl o por ml que se está observando en objetivo de 40X. Calcule el promedio de la cantidad de células por L. Si desea calcular el número de células por ml, simplemente multiplique la cantidad obtenida por 1000 (1 ml = 1000 µl). 0.20 mm Tenga en cuenta que la grilla central mide 1mm x 1mm de área, la cual se subdivide en 25 cuadrados y cada uno de estos cuadrados mide 0,2mm x 0,20mm x 0,1mm.

X=[(a*250):n] * Fd Siendo a= Número de células contadas, n número de cuadros y Fd= factor de dilución 6

X= [(114*250):1]*100 = 2,85x10^

12

células por uL o 2,85x10^ células por litro.

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Discusión. Para la primera actividad se observó una muestra fresca de cabello a través de un microscopio de campo claro y uno de campo oscuro, ambas con un aumento total de 400X y sin tinción. Primero se observó la muestra con el campo claro. Este microscopio sirvió para observar la muestra tal y como era, ya que este tipo de microscopio se caracteriza por no ocupar filtros (no altera los colores). Luego se observó el espécimen de cabello utilizando el microscopio de campo oscuro y se visualizó claramente un nivel de detalle superior al entregado al usar la técnica de campo claro, y esto es producto de que al utilizar un campo oscuro, la luz incide oblicuamente sobre la preparación de modo que la imagen se forma sólo con los rayos difractados por el espécimen (7). La segunda actividad se trataba de medir el diámetro promedio de los glóbulos blancos y rojos de una muestra, la cual correspondía a un frotis de sangre. Para esto se calculó el promedio de 10 glóbulos rojos, los cuales fueron escogidos al azar y se estableció un valor numérico correspondiente a las líneas de la reglilla que los delimitaban. En el caso de los glóbulos blancos solo se escogió uno. Posterior a eso se realizó la regla de 3, relacionando la cantidad de líneas de la reglilla (100 en total) con el tamaño que estas median (0,25 milímetros las 100) y con la cantidad de líneas que establecimos que correspondían a cada tipo de célula (GB y GR). Por último se realizó una conversión de unidades para que el resultado final estuviera en micrómetros. El resultado obtenido en los glóbulos blancos estaba en el rango normal de tamaño (8-20 µm) al igual que el tamaño obtenido de los glóbulos rojos (parámetros normales 6-8 µm) (8). La última actividad consistió en contabilizar el número de células en un litro de suspensión de eritrocitos. Para esto se utilizó una imagen referencial de una suspensión de eritrocitos con un factor de dilución de 1/100, se procedió a contar manualmente con la cámara de Neubauer el cuadro H3, obteniendo 114 células en ese recuadro. Luego se continuó utilizando la fórmula dada por Neubauer para calcular la cantidad de células por uL, la cual es la siguiente: X=[(a*250):n] * Fd; y obtuvimos el valor de 2,85 millones. Este valor se encuentra fuera del rango de normalidad de células por uL de sangre, el cual es de 4,5 a 6 millones para los hombres, y de 4,5 a 5,5 millones para las mujeres, por lo que lo más probable sería que la muestra corresponda a una persona con un tipo de anemia caracterizada por la deficiencia de glóbulos rojos, o la presencia de glóbulos rojos disfuncionales, y esto puede ser producto de la falta de una dieta rica en ácido fólico y/o vitamina B12 o la incapacidad de absorber esta última, lo que correspondería a anemia perniciosa(9)(10).

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Conclusión: A partir de las actividades de observación de muestras frescas (cabello), conteo de células (suspensión eritrocitos) y cálculo de tamaño promedio de GR y GB se pudo concluir que: ● La hipótesis fue acertada, debido a que el microscopio permitió contabilizar el número de células y el tamaño o diámetro de las partículas observada en una muestra. Sin embargo, para esta tarea se debe contar con reglilla, cámara de Neubauer y otros instrumentos para facilitar la obtención de estos cálculos. ● Se cumplió el objetivo de identificar las principales diferencias en la imagen del microscopio de campo claro con el de campo oscuro a cabalidad. Ambas técnicas fueron utilizadas con preparaciones sin tinción aplicada. Cuando se usó el microscopio de campo claro, la imagen obtenida fue brillante y el fondo menos brillante. En cambio, cuando se usó el microscopio de campo oscuro la imagen obtenida fue brillante y el fondo oscuro, por lo que se contrastaron más los detalles del espécimen observado. Además, se produjo un efecto de mayor nitidez a comparación de cuando se utilizó el de campo claro. ● La medición y conteo de los distintos tipos celulares fue exitoso, ya que se siguieron las instrucciones del uso de la reglilla y la cámara de Neubauer a cabalidad. Al comparar los resultados de tamaño promedio de los eritrocitos (GR) y leucocitos (GB), estos estuvieron en los rangos de normalidad establecidos. No sucedió así con el conteo de células , lo que demostró que la persona a la cual se le extrajo la muestra de sangre podría contar con anemia. ● La importancia de diluir las muestras iniciales fue reconocida, ya que si se posee una muestra sin diluir en solución buffer se hace imposible realizar un conteo efectivo de tipos celulares, ya que se observaría un amontonamiento de células, lo que no daría lugar a distinguir entre las limitantes entre partículas. Además, se identificó el por qué de su uso en muestras de frotis de sangre, ya que es común que esta muestra se coagule, impidiendo así el recuento de células. La creación del microscopio ha sido fundamental para el conocimiento interno de los seres vivos y en el desarrollo del conocimiento científico actual. Actualmente se sigue perfeccionando este instrumento, para llegar así algún día a conocer y observar el mundo atómico, mundo todavía desconocido para nosotros, pero no lejano.

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Referencias. (1) Oliva, N., Sánchez, R. Historia del microscopio y su repercusión en la Microbiología (2015). De Scielo. Sitio web: http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1727-81202015000200010 (2) Alberts B., Bray D., Hopkin K. et al. Introducción a la Biología Celular (2011). Editorial médica Panamericana, 3° edición. España. Páginas 6-7. (3) Prescott P., Harley J., Klein D. Microbiología. McGraw Hill (2004). Editorial Interamericana , 2° edición. España. Página 562. (4) Rojas C., Becerril. I. Uso y cuidado del Microscopio de Campo Claro (2015). Editorial Marbán, 1° edición. España. Páginas 19-20. (5) Guzmán U., Miguel A. Sífilis Diagnóstico y Manejo Serológico (2016). Instituto Nacional de Salud, 2° edición. Colombia. Páginas 83-86. (6) Bastidas O. Neubauer Chamber Cell Counting (2017). Editorial Random House, 1° edición. Estados Unidos. Páginas 1- 2. (7) Servicios técnicos de Investigación. Técnicas de Microscopía con Luz Visible y sus Aplicaciones (2015). Universidad de Alicante. España. Páginas 3-7. (8) Carr, J., Rodak, B. Atlas de hematología clínica (2017). Editorial médica Panamericana, 5° edición. Argentina. Páginas 56-57. (9) Crivilles J. La sangre y la médula ósea normales (2017). De AEAL (Asociación Española de Afectados por Linfoma, Mieloma y Leucemia) . Sitio web:http://www.aeal.es/leucemia-mieloidecronica-espana/1-la-sangre-y-la-medula-osea-normales/#:~:text=Las%20cifras%20normales%20de %20estos,16%20gramos%20para%20las%20mujeres.

(10) Paredes. P. Anemia (2019). De Mayo Foundation for Medical Education and Research. Sitioweb:https://www.mayoclinic.org/es-es/diseases-conditions/anemia/symptoms-causes/syc20351360#:~:text=Anemia%20por%20deficiencia%20de%20hierro.,hemoglobina%20para%20los%20gl%C3%B3bulos %20rojos....