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AUTONOMA UNIDAD XOCHIMILCO Informe de del Profesores: Norma Noguez Irvin Fabian Bonola Gallardo Equipo 7: Brenda Cordova Karen Miguel Zarza Becerra Jorge Informe de del Reactivos.............................................................................................................................

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“UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA” UNIDAD XOCHIMILCO

Informe de validación del Método Analítico

Profesores: Norma Angélica Noguez Méndez Irvin Fabian Bonola Gallardo

Equipo 7: Brenda Cordova Peña Karen Domínguez Muñoz José Miguel Zarza Becerra Jorge Hernández Rodríguez

Índice Informe de validación del Método Analítico.................................................................................1 Método Analítico..............................................................................................................................2 1.- Reactivos................................................................................................................................2 2.- Material y Equipo...................................................................................................................2 3.- Preparación de soluciones...................................................................................................2 3.1- Fase móvil............................................................................................................................2 3.2.- Solución diluyente..............................................................................................................2 3.3.- Preparación de solución....................................................................................................2 3.4- Preparación de solución de la muestra............................................................................3 4.- Estabilidad de las soluciones...............................................................................................3 5.- Procedimiento............................................................................................................................3 5.1.- Acondicionamiento del sistema............................................................................................4 5.2 Cálculos......................................................................................................................................4 5.Lavado de columna......................................................................................................................5 6.Sustancia de referencia de paracetamol..................................................................................5 7: Placebo.........................................................................................................................................5 8:Verificación del sistema...............................................................................................................5 8:Linealidad del sistema:................................................................................................................6 8.1: Gráfica de linealidad del sistema.......................................................................................6 9: Linealidad del método................................................................................................................7

9.1: Gráfica de linealidad del método ………………………………………………………………………..7 10: Exactitud y repetibilidad...........................................................................................................8 11: Precisión intermedia.................................................................................................................9 12: Estabilidad de la muestra de la solución...............................................................................9 13: Robustez..................................................................................................................................10 13.1: Parámetros cromatográficos..........................................................................................10 13.2: Criterio de aceptación.....................................................................................................10 14: Tolerancia.................................................................................................................................11 15: Especificidad...........................................................................................................................11 16: Conclusiones finales:.............................................................................................................11 17: Bibliografía...............................................................................................................................13

18: Anexos......................................................................................................................................13

Informe de validación del Método Analítico Informe No. IV-17-001

Producto: Paracetamol Tabletas 500 mg

Concentración: 500.00 mg

Principio activo: Paracetamol/cafeína

Título: Validación de método analítico para la cuantificación de paracetamol/cafeína, tabletas.

Proyecto No. 0017

Referencia: Método desarrollado en Universidad Autónoma Metropolitana Unidad Xochimilco, laboratorio G-208

Conclusión: El método analítico cumple con los criterios de aceptación para linealidad, precisión y exactitud, excepto en especificidad y robustez.

Realizado por

Realizado por

Jorge Hernández Rodríguez

Brenda Cordova Peña

Q.F.B

Q.F.B

Químico de Desarrollo analítico

Químico de Desarrollo analítico

Método Analítico Revisado por José Miguel Zarza Becerra Q.F.B Químico de Desarrollo analítico

1.- Reactivos Agua grado HPLC

Revisado por Karen Domínguez Muñoz Q.F.B Químico de Desarrollo analítico 1

Acetonitrilo grado HPLC Paracetamol

2.- Material y Equipo Balanza analítica Sistema de microfiltración Millipore Matraces de 10 mL, 25 mL, 50 mL Micropipeta 100-1000 mL Columna Hypersil ODS Cromatógrafo de líquidos de alta resolución “KNAUER”

3.- Preparación de soluciones 3.1- Fase móvil Preparar 1000 mL de fase móvil 85:15 Agua-ACN Filtrar 150 mL de agua grado HPLC en un sistema millipore, por el mismo sistema filtrar 850 mL de ACN. Mezclar la solución, y sonicar por 10 minutos antes (para desgasificar) de instalar en sistema cromatográfico. 3.2.- Solución diluyente Acetonitrilo grado HPLC 3.3.- Preparación de solución stock: paracetamol y cafeína Pesar aproximadamente y con exactitud 10 mg de paracetamol y transferir a un matraz volumétrico de 10mL, disolver con acetonitrilo y llevar aforo con acetonitrilo. Filtre a través de un embudo con papel filtro número 1. Pesar aproximadamente con exactitud 10 mg de cafeína y transferir a un matraz volumétrico de 10mL, disolver con acetonitrilo y llevar aforo con acetonitrilo. Filtre a través de un sistema a través de un embudo con papel filtro número 1. Tomar un alícuota de 0.2 mL de la solución de paracetamol, y 0.3 mL de la solución de cafeína y pasar a un matraz volumétrico de 10 mL y aforar con agua desionizada.

2

3.4- Preparación de solución de la muestra Pesar 10 tabletas de paracetamol/cafeína (500-50 mg), calcular peso promedio, triturar las tabletas. Pesar lo equivalente a 25 mg y disolver en 5 mL de ACN, sonicar por 5 min, tranferir a un matraz aforado de 10 mL y aforar con ACN, tomar alícuota de 0.2 mL, pasar a un matraz de 10 mL y aforar con agua desionizada. Filtrar, descartar los primeros 10 mL. Guardar el volumen restante e inyectar al cromatógrafo 20 μL

4.- Estabilidad de las soluciones Las soluciones de las muestras listas para análisis son estables mientras no estén en contacto con luz por no más de 24 hrs.

5.- Procedimiento Condiciones Columna: Hypersil ODS Fase Movil: Agua: ACN Proporción: 85:15 Velocidad de flujo: 1.5 mL/min Volumen de inyección: 20 uL Temperatura de la columna: T.A. Tiempo de corrida: 5.5 minutos

5.1.- Acondicionamiento del sistema Acondicionar el sistema cromatográfico durante 30 minutos o hasta obtener una línea base estable. Antes de inyectar las muestras, realizar una inyección de blanco diluyente para acondicionar el sistema. Inyectar al cromatógrafo tres réplicas de 20 μL de la solución 1, y calcular el C.V. de la respuesta obtenida no debe ser mayor al 2% Inyectar dos réplicas de 20 μL la solución “2”. Calcular el factor de recobro para la solución 1, el cual debe estar entre 98-102%.

3

5.2 Cálculos

Frec =

[ Ást 1] [ St 1] [ Ást 2] [ St 2]

t r ' =( tr−tm ) K '=

tr ' tm

Selectividad=

K '2 K '1

tr 2 ¿ w 0.5 N=5.545 ¿ Rs=

(tr 2−tr 1) ( w 0.5+ w 0.5)

IC (β1)= (β1) ± t

0.975, n-2

IC (β0)= (β0) ± t IC (μ)= (μ) ± t

Sb1

0.975, n-2

0.975, n-1

Sb0

S √n

|ⅆi|=|´y 1− ´y 0|

5.Lavado de columna Tiempo (min) 0 60 61

Flujo (mL/min) 1 1 1

Agua (%) 70 70 50

Metanol (%) 30 30 50

4

90 120 160

1 1 1.5

30 10 0

70 90 100

6.Sustancia de referencia de paracetamol No. De lote: 00124 Valoración: 100 % Vigencia: 06/12/17

7: Placebo Elaborado por Universidad Autónoma Metropolitana Unidad Xochimilco. El placebo para la especificidad, linealidad, exactitud y repetibilidad del método analítico fue desarrollado de acuerdo a la formula y al procedimiento de manufactura del Departamento de desarrollo de placebos de la Universidad Autónoma Metropolitana Unidad Xochimilco. 8:Verificación del sistema Parámetro

Valor

Criterio de aceptación

Factor de recobro

101.31 %

98 - 102 %

Coeficiente de variación

0.94 %

≤ 2%

Media

1116.751

N/A

Desviación estándar Factor de capacidad Factor de coleo Eficiencia Resolución Selectividad

10.542 2.525 N/A 3943.378 5.203 1.648

N/A >2 >2 N/A >2 >1

8:Linealidad del sistema: Nivel Concentración (ug/mL) 60% 60% 60%

12 12 12

Respuesta obtenida (Área) 595,0302 597,3753 612,1280

5

100% 20 100% 20 100% 20 140% 28 140% 28 140% 28 8.1: Gráfica de linealidad del sistema.

1113,2805 1106,5414 1112,3539 1108,5373 1108,2572 1114,9617

ABC = -50,4411 + 11,2048* %Concentración Pendiente 11,2048 Intervalo de -75.1463, 97.5559 confianza para pendiente Ordenada de -50,4411 origen Intervalo de -49.6202, -51.2619 confianza para ordenada al origen Coeficiente de 0.3288 % variación 0.9923 r2 media 1110.7253 Intervalo de 1101.6511, confianza para 1119.7994 la media Parámetro

Obtenido

CV 2 r

0.32 % 0.99

9: Linealidad del método Cantidad Concentració adicionada n final (mg) (mg) 6 6

Criterio de aceptación ≤ 2% ≥ 0.98

Respuesta obtenida

Cantidad recuperada

% Recuperado

525,5055

5,9664

99,4393

6

6

520,5807

5,9104

98,5074

6

6

532,2041

6,0424

100,7068

10

10

883,4119

10,0299

100,2987

C.V.

6

10

10

882,1382

10,0154

100,1541

10 14

10 14

876,7928 1228,2248

9,9547 13,9447

99,5472 99,6052

14

14

1238,9945

14,0670

100,4786

14

14

1223,8213

13,8947

99,2481

0.6961%

Cantidad recuperada = -0,014044 + 0,9994667*Cantidad adicionada

Pendiente Intervalo de confianza para pendiente Ordenada de origen

0,9994 0.9838, 1.0151

Intervalo de confianza para ordenada al origen

-0.1785, 0.1504

Coeficiente de variación

0.69 % 0,99 99.7761

2

r media Intervalo de confianza para la media Obtenido Parámetro IC (β1) 0.9838, 1.0151

-0,0140

99.2422, 100.3100 Criterio de aceptación El IC (β1) debe incluir la unidad

IC (β0)

-0.1785, 0.1504

El IC (β1) debe incluir el cero

CV

0.69%

≤ 2%

7

r

0,99

≥ 0.98

99.2422, 100.3100

El IC (μ) debe incluir el 100

2

IC (μ)

10: Exactitud y repetibilidad Cantidad adicionad a (mg)

Concentració n final (ug/mL)

Respuesta obtenida

Cantidad recuperada

% Recuperado

10

10

873,2125

10,1170

101,1698

10

10

845,6097

9,7972

97,9717

10

10

841,5861

9,7506

97,5056

10

10

845,6908

9,7981

97,9811

10

10

881,5303

10,2133

102,1335

10

10

852,106

9,8724

98,7244

Parámetro

Valor

Criterio de aceptación

Media

99,2476

98 -102 %

CV

1,9414 %

≤ 2%

IC (μ) 11: Precisión

Repetición Día

97,2256, 101,2697 Analista 1 ABC

El IC (u) debe incluir el 100% del recobro. Analista 2 ABC intermedia

853,28

893.107

858,1103

881,395

841,774

870,1232

867,9003

894,9179

871,8225

865,5478

861,8117

866,7716

CV

1,25 %

1.49 %

Media total

859 1164

878 6437

Día 1

Día 2

8

Parámetro

Obtenido

Criterio de aceptación

CV total

1.37 %

≤ 2%

Diferencia de media

868.88

12: Estabilidad de la muestra de la solución. Propuesta: Para determinar la estabilidad de las muestras analizadas, se recomienda preparar por triplicado concentraciones al 100% de paracetamol, colocar una en diferentes condiciones de temperatura: -

Temperatura ambiente (20-25ºC) Temperatura a 37ºC Temperatura de 2-8 ºC (refrigeración).

Realizar mediciones cada 8 horas durante 24 horas incluyendo el tiempo 0 y determinar la pureza, potencia o contenido, utilizando un estándar de referencia que debe prepararse en el momento. Calcular la media aritmética del análisis inicial, y de cada condición de almacenaje, y calcular la diferencia absoluta de la media aritmética de cada condición de almacenaje respecto del análisis inicial (di).

Parámetro

Obtenido

Criterio de aceptación

CV

N/A

≤ 2%

di

N/A

Menor al 2%

9

13: Robustez Condición (mL/min) Flujo 1.5 ABC Flujo 2.0 ABC 884.968 893.107

Muestra 1

13.1: Parámetros cromatográficos Condición Tiempo de (Flujo) Eficienci retención a 1.5 (Y1) 2.0 (Y0)

1345.67 1138.97

3.5805

Resolución

Factor de coleo

(%) de recobro

3.0183 5.5427

5.741 2.356

N/A N/A

100.00 103.5805

3.283 2.833

13.2: Criterio de aceptación Parámetro Obtenido di

Factor de capacidad

Criterio de aceptación Menor al 2%

14: Tolerancia Propuesta: Realizar un triplicado de producto terminado (cafeína + paracetamol) al 100% en dos equipos cromatográficos diferentes para determinar el factor ajeno al método (de igual manera se puede realizar cambiando columna o lote de reactivo empleado para el análisis). Calcular media aritmética, desviación estándar, coeficiente de variación, del contenido, potencia o valoración. Parámetro

Obtenido

Criterio de aceptación

CV

N/A

≤ 2% 10

15: Especificidad Propuesta: Para la validación del método analítico de tabletas de paracetamol, se debe determinar las sustancias interferentes que puedan afectar en el análisis cromatográfico. Se deberá preparar un triplicado al 100% al que se le agregará una cantidad específica de impurezas o bien, someterse a condiciones de luz, calor, humedad, oxidación.

Parámetro

Especificidad

Obtenido

Criterio de aceptación

Se observó un doble pico que corresponde a un metabolito de degradación del paracetamol (Ver Fig.10 en ANEXOS)

La respuesta del método únicamente debe ser debida al analito.

16: Conclusiones finales: Se estableció una metodología analítica para la determinación de paracetamol/cafeína por mediante cromatografía de líquidos de alta resolucion. Linealidad, exactitud y precisión del sistema: Se comprobó la linealidad mediante ≥ 0.98, una gráfica de correlación entre variables (x,y), obteniendo r 2 además se corroboró que el valor de la pendiente es significativamente distinto de cero, que el intercepto no se encuentra estadísticamente alejado de cero y que el intervalo de confianza incluye el valor de cero. Para el estudio de la exactitud y precisión, se demostró que el porcentaje de recuperación promedio está dentro de los criterios de aceptación. Para precisión presenta un CV menor al 2 %, siendo una metodología precisa.

11

Se concluye que el sistema es lineal, exacto y preciso. Linealidad y exactitud intermedia del método: Se comprobó la linealidad del método analítico, mediante una gráfica de correlación de cantidad adicionada contra cantidad recuperada, el valor de r 2 fue ≥ 0.98, por lo que se concluye que el método es lineal. Precisión intermedia: Se determinó la precisión del método, con dos analistas diferentes, de dos días y se calculó el CV el cual fue menor al 2%, por lo que se concluye que el método es reproducible y preciso entre dichos analistas. Robustez: Se determinó la robustez del método mediante la lectura de dos muestras con diferente velocidad de flujo (1.5 y 2.0 mL/min), se calculó la diferencia absoluta de medias aritméticas mostrando un valor mayor al 2%. Por otra parte, se calcularon parámetros cromatográficos de cada condición, para el flujo 2.0, se presenta una eficiencia aceptable, además de que el tiempo de retención es menor que el del flujo 1.5, sin embargo, el flujo 2.0 presenta una baja resolución con respecto al flujo recomendado por la FEUM 11 ed. Por lo que se recomienda utilizar el flujo 1.5 mL/min. Se concluye que el método no es robusto para estas condiciones. Especificidad: Se determinó la especificidad del método analítico, mediante el tratamiento de una muestra en condiciones de oxidación con peróxido de hidrógeno a 37ºC. En el cromatograma (ver fig. 10) se observa la ruptura de un pico que simulan dos picos traslapados, que uno corresponde a paracetamol y el otro que es un producto de degradación debido a la oxidación, sin embargo, no es posible cuantificar el área bajo la curva de cada pico por lo que se concluye que el método no es específico para está condición.

17: Bibliografía - A. García; E. Soberón, M. Cortés; R. Rodríguez; J.L. Herrera; A. Alcántara. Guía de validación de método analíticos. (2012). Colegio Nacional de Químicos Farmacéuticos Biólogos México, A.C. - Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos 11 Ed.

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18: Anexos NOTA: Los demás da...