Informe N°2- Tincion GRAM Grupo 1 PDF

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INFORME DE LABORATORIO NºBellavista, febrero del 2021“TINCIÓN DE GRAM”ASIGNATURA: MicrobiologíaGRUPO HORARIO: 92GDOCENTE:  Herrera Sánchez Sonia ElizabethINTEGRANTES:  Pérez Guerrero, Lesly  Pineda Castañeda, Vanessa  Ponce Cáceres, Rodrigo  Suárez Bernabé, AlexandraUNIVERSIDAD NACIONAL DELCAL...

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UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CALLAO

MI MIC CROBIO ROBIOLOGIA LOGIA

“TINCIÓN DE GRAM” INFORME DE LABORATORIO Nº3 ASIGNATURA: 

Microbiología

GRUPO HORARIO: 92G DOCENTE: 

Herrera Sánchez Sonia Elizabeth

INTEGRANTES: 

Pérez Guerrero, Lesly



Pineda Castañeda, Vanessa



Ponce Cáceres, Rodrigo



Suárez Bernabé, Alexandra

Bellavista, febrero del 2021

I.

INTRODUCCIÓN

El presente informe se realizó con la finalidad de dar a conocer información acerca de la Tinción de Gram, la cual es una técnica de laboratorio que ayuda al reconocimiento de microorganismos como lo son las bacterias, gracias a esto es posible identificarlas más rápidamente en una infección y seleccionar qué tipo de antibiótico es el más adecuado para su respectivo tratamiento. La técnica consiste en añadir colorantes a una muestra que contenga bacterias, luego estos colorantes teñirán la pared de las bacterias de color morado, como siguiente paso se realiza un lavado del según lo que observemos determinaremos a qué tipo de bacteria pertenece. Si después del lavado permanece de color morado se trataría de una bactería Gram positiva, pero si queda teñido de color rosado, se trataría de una bacteria Gram negativa. En esta ocasión haremos el estudio de la especie bacteriana Coliformes, y procederemos a brindar características de dos bacterias en específico, las cuales son : Enterobacter cloacae y Escherichia coli.

II. 

OBJETIVOS Realizar la tinción Gram de coloración bacterianas y evaluar su comportamiento en las bacterias Coliformes.



Distinguir bacterias Gram (+) de las bacterias Gram (-).



Reconocer algunas formas bacterianas observadas en el microscopio.



Adquirir destreza en la prelación de frotis bacterianos.

III.

MARCO TEÓRICO

 TINCIÓN DE GRAM: La Tinción de Gram consiste en una técnica de laboratorio diseñada por Christian Gramen el año 1884. El objetivo de Gram era conseguir una prueba con la que fuera posible diferenciar diferentes grupos de bacterias para así poder estudiarlas y clasificarlas. Según la distribución del peptidoglicano de la pared celular que las envuelve, se tiñen de una forma u otra. Así, las bacterias que no se tiñen mediante esta técnica se denominan Gram negativas. Están formadas por una pared más fina formada por menos capas de peptidoglicano y una segunda membrana rica en lípidos (que repele la tinción Gram), al microscopio aparecen incoloras. El cristal violeta se une a la pared bacteriana y se estabiliza con el lugol. La mezcla alcohol-acetona disuelve la membrana externa de las bacterias Gram negativas (más fina que la de las Gram positivas) extrayéndose el cristal violeta. Después se tiñen solo las Gram negativas con safranina.  BACTERIAS GRAM POSITIVAS Se le denomina bacterias grampositivas, o bacterias Gram positivas, a aquellas que se tiñen de azul oscuro o violeta por la tinción de gram. Esta característica química está íntimamente ligada a la estructura de la envoltura celular, por lo que refleja un tipo natural de organización bacteriana. La pared celular de las bacterias Gram positivas está formada en un 90% por peptidoglicano,

siendo

éste

el

principal

componente

que

permite

diferenciarlas con la pared de las Gram negativas, pues al teñirlas, es gracias a él, al grosor que éste le proporciona, que se logra mantener la coloración del cristal violeta en el interior de la célula al teñirla con la tinción Gram. Además del peptidoglicano, ésta se encuentra compuesta de ácidos teicoicos, los cuales están presentes en pequeñas cantidades. Éstos se presentan embebidos en la pared de la bacteria como polisacáridos ácidos.

 BACTERIAS GRAM NEGATIVAS Las bacterias gramnegativas se clasifican por el color que adquieren después de aplicarles un proceso químico denominado tinción de Gram. Las bacterias gramnegativas se tiñen de rojo cuando se utiliza este proceso. Otras bacterias se tiñen de azul, por lo que se denominan bacterias grampositivas. Las bacterias grampositivas y gramnegativas se tiñen de forma distinta porque sus paredes celulares son diferentes. También causan diferentes tipos de infecciones, y hay distintos tipos de antibióticos eficaces contra ellas. Las bacterias gramnegativas están encerradas en una cápsula protectora. Esta cápsula ayuda a evitar que los glóbulos blancos (que combaten las infecciones) ingieran las bacterias. Bajo la cápsula, las bacterias gramnegativas tienen una membrana externa que las protege contra ciertos antibióticos, como la penicilina. Al deteriorarse, esta membrana libera sustancias tóxicas llamadas endotoxinas, que contribuyen a la gravedad de los síntomas en las infecciones por bacterias gramnegativas.  LUGOL El Lugol o disolución de Lugol es una disolución de yodo molecular y yoduro potásico en agua destilada. Se preparó por primera vez en 1829 y recibe su nombre en honor al médico francés Jean Guillaume Auguste Lugol. Se emplea en microbiología en la tinción de Gram para retener el colorante cristal violeta,

también

se

utiliza

como

contraste

visual

en

parasitología; se utiliza esta disolución como indicador en la prueba del yodo, que sirve para identificar polisacáridos como los almidones, glucógeno y ciertas dextrinas, formando un complejo de inclusión termolábil que se caracteriza por presentar distintos colores según las ramificaciones que presente la molécula de polisacárido.  SAFRANINA La safranina O es un colorante biológico también conocido como dimetil safranina y rojo básico 2, se utiliza en la Tinción de Gram para proporcionar un color violeta más intenso a las bacterias Gram+ y tiñe de rosa a las bacterias G-.

 CRISTAL VIOLETA En la forma pura, el cristal violeta se presenta como cristales de color azul verdoso brillante. Su punto de fusión está entre 194°-189°C. El violeta de metilo 10B es conocido como violeta de genciana y es el ingrediente activo en el colorante de Gram, usado para clasificar bacterias. IV.

EQUIPOS Y MATERIALES 

Muestra



Tubos de ensayo



Colorantes: cristal violeta, Lugol, alcohol acetona, safranina



Piceta



Asa bacteriológica



Cristalizador y varilla de tinción



Estufa



Microscopio óptico



Cabina de bioseguridad



Portaobjetos



Mechero de alcohol

V. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL Tinción de Gram: En la tinción de Gram el cristal violeta tiñe todas las células de color violeta. El yodo (lugol) forma un complejo insoluble de yodo-cristal violeta-pared celular. El etanol decolora totalmente las bacterias Gram-negativas, pero no las Grampositivas, a causa de las diferencias en la estructura de la pared. La safranina es un colorante que contrasta notablemente con el azul violeta, tiñendo las bacterias Gram-negativas de rojo. Procedimiento: 1. Lavar y desengrasar un portaobjetos con alcohol. 2. Poner una gota de cultivo sobre el portaobjetos. Fijar por calor, sin quemar las células. 3. Teñir 1 minuto con cristal violeta. 4. Lavar con agua 5. Teñir 1 minuto con lugol 6. Lavar con agua 7. Desteñir 30 segundos con etanol 8. lavar con agua 9. teñir 1 minuto con safranina 10. lavar con agua, secar y observar al microscopio Preparación para la tinción de Gram para la Escherichia Coli (Coliforme): Procedimiento: 1.Tomar una asada de cada uno de los tubos positivos de caldo EC y sembrar por estría cruzada en agar eosina azul de metileno para su aislamiento. 2. Incubar las placas invertidas a 35°C por 18-24 h. 3. Seleccionar dos colonias de cada placa con la siguiente morfología colonial: Colonias con centro negro, planas con o sin brillo metálico. Si no hay colonias con morfología típica, probar una o más colonias lo más parecido E. coli de cada placa y sembrarlas en agar cuenta estándar para realizar las pruebas de morfología microscópica y pruebas bioquímicas. 4. Incubar las placas a 35°C por 18-24 h. 5. Hacer un frotis y teñirlo por Gram con los 10 procedimientos anteriores. Observar al microscopio la presencia de bacilos cortos o cocobacilos Gramnegativos.

VI. RESULTADOS El método de tinción de Gram pudo determinar que La Escherichia Coli es una bacteria Gram negativa utiliza. El método de tinción de Gram ayudó a identificarla y aislar su presencia. El fundamento de la técnica se basa en las diferencias de las paredes celulares entre las bacterias Gram negativas, donde la capa de peptidoglicano es delgada y las de las bacterias Gram positivas con capas gruesas. Esta diferencia de espesores de paredes tiene como ventajas que las bacterias se tiñen diferentes siendo más fácil su identificación. El método pone a prueba la resistencia a la decoloración para identificar una bacteria Gram negativa de la Gram positiva. La Gram negativa es soluble en compuestos orgánicos y sus paredes delgadas permiten que se escape el complejo violeta/yodo perdiendo la coloración (azulviolácea), caso contrario con las Gram positivas que por poseer paredes más gruesas impiden escapar el complejo manteniendo la coloración (Azul/violeta).

VII. DISCUSIONES Redondo M. (2011) nos dice que en la determinación de la Escherichia Coli mediante la tinción de Gram, esta pierde su coloración debido a que es un tipo gram negativa, afirmando lo que se dijo en los resultados, además otros autores como Arías M. (2011) también nos confirma que en la determinación de Escherichia Coli debido a que sus paredes son delgadas pierde la coloración y se confirma que es una Gram Negativa

V.

REFERENCIAS Bush, Larry. (2019). Introducción a las bacterias Gram positivas. Recuperado

de:

https://www.msdmanuals.com/es/hogar/infecciones/infeccionesbacterianas-bacterias-grampositivas/introducci%C3%B3n-a-lasbacterias-grampositivas. Bush, Larry. (2020). Introducción a las bacterias Gram negativas. Recuperado

de:

https://www.msdmanuals.com/es/hogar/infecciones/infeccionesbacterianas-bacterias-gramnegativas/introducci%C3%B3n-a-lasbacterias-gram-negativas. Benson Harold. 1979 microbiological applications, a laboratory manual in general microbiology. Third edition. Wm, C. Brown Company Publisher. Dr. Jatin, M. 2011 medline plus información de la salud tinción de Gram [05 dic. 2014] pag. 2 Mauricio Redondo. 2011 Comparación de métodos para el análisis de coliformes totales. Recuperado de: http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Analisis_Agua_NMP_22309.pdf

VI.

CUESTIONARIO: 1. Explique el mecanismo químico de la tinción de Gram, refiriendo la reacción entre los reactivos y los componentes de la pared celular: La reacción de tinción de Gram se ve afectada por la alteración física de la pared celular bacteriana o protoplasto. Las paredes celulares de las bacterias grampositivas interponen una barrera que evita la absorción del complejo colorante desde el citoplasma. Las paredes celulares de las bacterias gramnegativas contienen lípidos solubles en disolventes orgánicos, que luego se liberan para descolorar el citoplasma. Por consiguiente, un microorganismo físicamente alterado por exceso de calor no reacciona a la tinción de Gram de la manera prevista. 2. Investigue a qué se debe la afinidad de los colorantes básicos por las bacterias, y a qué la de los ácidos. COLORANTES BÁSICOS: Se denominan colorantes básicos si el cromóforo (porción coloreada) de la molécula está cargada positivamente, por ejemplo, cristal violeta y azul de metileno son colorantes básicos. El colorante básico entra al microorganismo, donde forma con el yodo una laca insoluble en agua. El alcohol o la acetona empleados para aclarar, deshidrata las paredes de los microorganismos gram positivos, tratados con mordiente, y forma una barrera que la laca no puede atravesar. En las células gram negativas, los lípidos de la pared (más abundantes que en las células gram positivas) se disuelven por este tratamiento, lo que permite el escape del complejo de cristal violeta con yodo. COLORANTES BÁSICOS: Las dos tinciones diferenciales más utilizadas en bacteriología son la tinción de gram y la tinción de ácido alcohol resistencia. Se trata de un procedimiento de tinción diferencial, conocido como método de Ziehl-

Neelsen, que tiene gran relevancia por su aplicación clínica. Permite poder distinguir aquellos microorganismos cuya coloración resiste la acción de alcoholes y ácidos suaves (ácido-alcohol resistentes) de otros que no resisten la decoloración (no ácido-alcohol resistentes). Dentro de las bacterias ácido alcohol resistentes encontramos dos importantes patógenos: Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium leprae, microorganismos responsables de la tuberculosis y la lepra respectivamente.

3. ¿Por qué los colorantes negativos no penetran a la bacteria? Debido a que las células bacterianas son ricas en ácidos nucleicos y estas poseen carga negativa en forma de fosfatos, por ende, poseen mayor afinidad con los colorantes básicos. La superficie bacteriana a pH neutro está cargada negativamente.

VII.

ANEXOS A continuación, se presentará una tabla que contiene las características del grupo de especies bacterianas llamadas Coliformes.

BACTERIA

NOMBRE

CARACTERÍSTICAS

ENFERMEDAD

*Bacterias Gram negativas *Oxidasa negativo

*Infecciones

*Catalasa positivo

intrahospitalarias

*Aeróbicos y anaeróbicos Enterobacter cloacae

*Forma de bastoncillo

*Otitis media

*Aneróbica facultativa *Celulitis

*No presenta cápsula ni esporas *No fermenta la lactosa *Produce gas como resultado de la fermentación de la glucosa.

*Sepsis neonatal

*Forma parte de la flora intestinal en humanos *Asociado

a

infecciones

de

urinario

abdominal

bien

las

manos con agua y jabón. *Tener

hábitos *Uso malonato

propios de un estilo de vida saludable.

*Test VP

suficiente *Test indol

Hacer

infección tracto

*Lavarse

LABORATORIO

*Alimentarse bien

*Bacteriemia, respiratoria,

PRUEBAS DE

PREVENCIÓN

origen nosocomial

*Móvil gracias a la presencia de flagelos peritricos

PATOGENIA

del y

ejercicio. *Dormir

el

necesario.

tiempo

*Náuseas

*Manipule la comida

o

con seguridad.

vómitos *Capacidad

*Bacilo gran negativo

*Fuertes

*Oxidasa negativo

coli

de

crecimiento

preferente es a 37 °C (mesófilo) *Fimbriado *Comúnmente

es

flagelos perítricos.

las

células

del

epitelio intestinal.

*Anaerobio facultativo *Temperatura

cólicos penetrar e invadir

abdominales

*Catalasa positivo Escherichia

de

móvil

por

*Diarrea líquida o con

mucha *Pueden

sangre

exotoxinas producción diarreas.

*Fiebre

bien

las

carnes, lave las frutas y verduras antes de comerlas.

*PCR a Tiempo *Evite la leche y los Real jugos sin pasteurizar. producir *Tincion de Gram *La infección también

responsables de la *Cansancio

*Cocine

de

se puede adquirir al tragar agua en una piscina contaminada con humanos.

desechos

VIII. 

RECOMENDACIONES Usa un frotis bucal para practicar, ya que la muestra debe contener bacterias tanto Gram positivas como Gram negativas. Si solo ves uno u otro tipo de bacteria, es probable que hayas usado muy poco o demasiado decolorante.



Puedes usar una pinza para ropa de madera con resortes para sujetar el portaobjetos.



Como decolorante, el etanol actúa con más lentitud que la acetona.



Sigue las precauciones estándar para el laboratorio.



Es conveniente estandarizar los tiempos de tinción ya que la calidad y concentraciones de reactivos pueden variar bastante-



Las bacterias anaerobias son mas dificiles de teñir, esto puede mejorar si se agrega bicarbonato mezclado a las tinciones



La muestra no debe ser excesiva para poder determinar las otras caracteristicas de la bacteria, como forma y agrupación...