K 2 BCM Chromatographie PDF

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Biochemie...

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Freitag, 1. Mai 2020

K_2_BCM_Praktikum Chromatographie!

- Moleküle in einer mobilen Phase werden auf einer stationären Phase aufgetrennt! • Lässt sich analytisch und preparativ genutzt! • Proteine und Nukleinsäuren können aufgreinigt werden! • Die Masse von Biomolekülen kann bestimmt werden! • Man kann Interaktionen zwischen Biomolekülen veranschaulichen! - Preparativ: ! • Säulenchromatochraphie (liquid. Chr. - LC) => meist verwendet! • High pressure/ performance Chr. (HPLC)! - analytisch:! • HPLC! • Thin layer Chr. TLC (Dünnschicht Chromatographie)! • Gas Chromatography! - Säulenchromatographie:! • Flüssigkeit (mobile Phasen) mit Molekülen wird auf Säule aus poröser Matrix (stationäre Phase)!

• Die Pumpkraft kommt durch die Gravitation! • Was unten rauskommt ist die ELUTION ( eluiert als erstes, zweites, …)! - Heigh-pressure-Chromatography! • Mobile Phase wird gepumpt => Schneller, genauer! • Die eluierten Proteine werden von Detektor (zB UV) wahrgenommen! • Fraction collector: Die delektierten Proteine werden in verschiedene Eppendorfgefäße gefüllt!

- Vereinfachte Varianten während des Praktikums! • Statt HPLC: Eppi mit Einsatz der stationäre Phase beinhaltet und auf den dann die mobile Phase gegeben wird => dann zentrifugiert!

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Freitag, 1. Mai 2020

- => bei Affinitätschromatographie (Ni2+NTA spin columns) und IonenAustausch-Chromatographie (DE52-spin columns)!

• Gelfiltration mit Sephadex 100 in einer Pasteurpipette => Schwerkraft reicht! - Affinitätschromatographie: • Ablauf:! - Spezieller Ligand eines Protein wird durch angegangene Gruppe befestigt!

- Lösung mit verschiedenen Proteinen wird hinzugegeben; nur die gesuchten binden an den Liganden!

- Mit Salzlösung werden die anderen weggewaschen! - Die Proteine werden eluiert in dem freie Liganden im Überschuss hinzugegeben werden, Proteine binden an die freien Liganden und können eluiert werden!

• Ni2+NTA-Affinitäts-Aufreinigung! - DsReM: DsRed-Monomer fluorescent Protein, im Praktikum verwendet; zyklisches Protein!

- Herstellung durch extrahiertes Gen, was in e.coli gebracht wurde!

- Gen wurde genetisch Modifiziert => Einfügen von 6 Histidin im Nterminus => H-schwanz für Ni2+NTA-Affinitäts-Aufreinigung!

- NTA (Nitrilo-tri-acetic-acid): bindet an Säulenmaterial und hat am anderen Ende ein immobilisiertes Nickel-Ion!

• Das kann je zwei der Histidinreste binden! - Elution:! • pH-Wert erniedrigen: beide N´s des Histidin binden H+; Protein gelöst! • EDTA hinzufügen: Bildet Komplex mit Nickel -> Protein gelöst! • Imidazol hinzugeben => konkurriert mit NTA um Protein => Protein gelöst! 2

• => keine absolute Aufreinigung => zweite Chromatographie, die auf anderen Proteineigenschaften beruht nötig!

- Anionenaustausch-Chromatographie: • Nun wird eine weiter Eigenschaft genutzt um DsReM aufzugeinigen! • Der Isoelektrsiche Punkt von DsReM mit getaggtem Schwanz bei 5,9 also leicht negativ => hängt am Mengenverhältnis der ungeladenen und pos. Und neg. Geladenen AS im Protein!

• Anionen-Austausch-Chromatographie:! - Das auszutauschende Protein ist negativ geladen (Anion). ! - Die stationäre Phase ist positiv geladen (Diethylaminoethyl)! • Kationen-Austausch-Chromatographie:! - Auszutauschendes Protein positiv! - Stationäre Phase negativ: MonoS! - => die Ionen die am besten mit der stationären Phase interagieren laufen am langsamsten Über die Säule und eruieren als letztes!

- Hinzugeben der Lösung der ersten Chromatographie: !

- => gute Interaktion der neg. Geladenen DsReMProteine!

- Spülen mit mildem Salzpuffer: Schlecht gebundene Ionen lösen sich!

- Spülen mit hoch-konzentriertem Salzpuffer; Konkurrenz um stationäre Phase => Proteine lösen sich! 3

Freitag, 1. Mai 2020

- Gel-Filtration bzw. GrößenausschlussChromatographie! • Ausschluss nach Größe und Form! • Funktioniert Gegenläufig zur Gelelektrophorese: große Proteine laufen am schnellsten über die Säule!

• Stationäre Phase ist eine poröse Matrix:! - Große Proteine passen nicht in die Poren; fließen am Material vorbei! - Ganz kleine Salze passen in alle Poren und durchfließen die ganze Matrix! - Drei Teststoffe:! • Dextran: Polysaccharid mit gekoppeltem blauen Farbstoff; Gewicht: Mr= 2Mio Da!

• Azorubin: kleines Farbstoffmolekül (E122); Mr= 604 !

• Myoglobin: Protein; Mr = ?! - V0 = Ausschlussvolumen: Große Proteine werden von der Matrix ausgeschlossen => Ve Dextran = V0!

- Mittelgroße Moleküle passen in manche Poren (V eluiert = Ve) => Myoglobin! - Peptide, Ionen und andere kleine Moleküle passen in alle Poren => Vt = Ve Azorubin!

• Die relative Migration ist das Auschlussvolum geteilt durch das individuelle Elutionsvolumen => R!

- R ist meistens proportional zum Logarithmus der Molekularmasse!

- => so kann man anhand des linearen Graphen das Gewicht eines unbekannten Proteins anhand dessen R berechnen!

- Versuch im Praktikum:! • Mischung aus allen drei Proteinen; Blau, rot und orange => Zusammen braun! - Werden auf Pasteurpipette mit Sephadex G-100; Dann immer weiter Puffer rauf geben!

- Nach verschiedenen Zeiten eluieren die einzelnen Moleküle! - Dann kt bestimmten Werten Masse auf dem Graph ablesen => Masse Myoglobin =Mr= 16.900

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