Chromatographie d’exclusion stérique PDF

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Cours de chimie analytique à la Haute Ecole de Louvain....

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Chromatographie d’exclusion stérique

Sommaire 1 Chromatographie d’exclusion stérique

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Chapitre 1 Chromatographie d’exclusion stérique La chromatographie d’exclusion stérique repose sur la rétention sélective des molécules en fonction de leur taille sur une phase stationnaire poreuse par rapport à une phase mobile liquide. Elle correspond à une chromatographie liquide. Remarque : il n’y a pas d’interactions directes entre le soluté et la phase stationnaire. Elle a diverses terminologies : 1. Chromatographie d’exclusion stérique (CES) ou size exclusion chromatography (SEC). 2. Chromatographie de perméation sur gel. 3. Chromatographie de filtration sur gel. On note le volume de rétention VR : VR = Vi + Kd Vp . Vi est le volume interstitiel (volume de phase mobile libre entre les grains). Vp est le volume poreux (volume de phase mobile à l’intérieur des pores). Kd est le coefficient de diffusion compris entre 0 et 1. Pour un soluté qui diffuse parfaitement, Kd = 1 et VR = Vi + Vp . Pour un soluté qui est totalement exclu, Kd = 0 et VR = Vi . Entre ces deux valeurs, le soluté est non totalement exclu, et la diffusion est non totale ; on parle de 3

perméation sélective : 0 < K d < 1. Une phase stationnaire est caractérisée par une droite d’étalonnage : log(M) = f (VR ) avec M la masse molaire.

log(M) exclusion totale perméation totale

Vi + Vp

Vi

VR

La partie linéaire doit correspondre au domaine des masses molaires à séparer. Connaissant VR , il est possible après étalonnage de déduire la masse molaire du soluté.

log(M)

{

Vi

VR

Vi + Vp

VR

Pour des échantillons hydrosolubles (protéines, polysaccharides) : 1. La phase mobile est aqueuse. 2. La phase stationnaire est composée de gels, ce sont des polymères à base d’alcools polyvinyliques, de polyacétates de vinyle, dextran (polysaccharides) ou copolymères. Pour des échantillons liposolubles (polymères) : 1. La phase mobile est organique : CHCl3 , THF. 4

2. La phase stationnaire est composée de gels de copolymère styrènedivinylbenzène.

Application : on prend une colonne (D = 7,5 mm, L = 300 mm) dont le domaine de perméation de la phase stationnaire s’étend de 400 à 300 000 daltons. L’éluant est du THF, débit 1 mL/min, la détection se fait aux UV à 254 nm. L’étalonnage se fait avec un mélange de polystyrènes de masses moléculaires connues. On observe 5 pics sur la gamme d’étalonnage avec des masses molaires allant de 34500 à 162 en passant par 9200, 3450 et 580. 1. Calculer le volume d’exclusion totale (volume interstitiel) et le volume des pores de la colonne utilisée. 2. Calculer le coefficient de diffusion K pour le composé de masse 3250 Da. 3. On observe quelque fois en chromatographie d’exclusion stérique des valeurs de K supérieures à 1. Interpréter ce phénomène. 1. La plus grosse molécule (34500 Da) est totalement exclue et est éluée à 4,5 min. Le débit de la colonne est de 1 mL.min−1 , donc Vi = 4, 5 mL. La plus petite molécule (162 Da) est éluée à 8,25 min, Vi + Vp = 8, 5 mL, d’où, Vp = 8, 25 − 4, 5 = 3, 75 mL. 2. Pour le composé à 3250 Da, élué à 5,6 min, VR = 5, 6 mL et, K = VR −

Vi = 0, 29. Vp

3. Si K > 1, il y a des interactions entre le soluté et la phase stationnaire. C’est un phénomène qui s’ajoute à la diffusion dans les pores.

5...