Chromatographie CM3 - L2 CB-SVT S4 PDF

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CHROMATOGRAPHIECHAPITRE 3 : ANALYSE QUANTITATIVE PAR CHROMATOGRAPHIELIQUIDECMDeux conditions nécessaires : - Disposer du composé que l’on veut doser à l’état de référence (à l’état pure) pour déterminer la sensibilité du détecteur - Disposer d’un moyen pour déterminer les aires (phases liquide) /hau...

Description

CHROMATOGRAPHIE CHAPITRE 3 : ANALYSE QUANTITATIVE PAR CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE CM3 Deux conditions nécessaires : - Disposer du composé que l’on veut doser à l’état de référence (à l’état pure) pour déterminer la sensibilité du détecteur - Disposer d’un moyen pour déterminer les aires (phases liquide) /hauteurs du pic d’élution (phase gazeuse)

I.

Quantité du pic injecté Le signal du détecteur est proportionnel à la concentration du soluté en sortie de colonne. L’aire ou la hauteur du pic sont proportionnelles à la quantité injectée de soluté, c’est la relation linéaire. L’ire du pic est la zone hachurée. Cette relation n’est que pour une gamme de concentration.

II.

Méthode d’étalonnage externe

Cela permet de déterminer la teneur (concentration ou pourcentage massique) d’un ou plusieurs constituants d’un mélange. Cette méthode est applicable quand le volume injecté est constant. Cette méthode est basée sur une comparaison de chromatogramme.

Créf et Aréf sont connus, on va donc être capable de déterminer l’aire du pic. Puis on injecte un échantillon de plusieurs composés, il y a donc plusieurs pics. Dans un 1er temps, on va identifier l’espèce que l’on veut doser par la grandeur du temps de rétention. T1 et t2 sont identiques, mais la concentration de l’échantillon est inconnue, même si l’on connait l’aire du pic. k est le coefficient de réponse au détecteur. On simplifie car V et k sont identiques. On ne possède qu’une seule inconnue, on peut donc la résoudre pour retrouver Céch. è La courbe d’étalonnage : A=f(Créf) On prépare des solutions contenant le soluté à une concentration connue (solutions étalons) : C1, C2, C3…Ci, …,Cn Puis on injecte chaque solution et on mesure l’aire du pic correspondant : A1,A2, A3,…, Ai,…,An Puis, on injecte la solution inconnue d’échantillon : Aéch, Céch

On trace la courbe de calibration, puis on va injecter l’échantillon inconnue. Cette dernière possède un pic qui doit être compris dans notre domaine de linéarité. On peut déterminer l’aire sur le graphique et la reporter sur la courbe de calibration. Cela va donc permettre de déterminer de manière quantitative la concentration.

CHAPITRE 4 : CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE PERFORMANCE (CLHP) La CLHP est la CL (chromatographie liquide) est la plus connue, son application recouvre une grande partie de la CPG et de l’analyse des composés thermosensibles, polaires ou de grande masse moléculaire.

I.

Appareillage

La circulation de PM à travers des canalisations courtes et de faibles diamètres interne (0,1mm) en acier inoxydable ou en PEEK (PolyEther-EtherKetone) qui résistent aux solvants et aux hautes pressions (350 bars). Les liquides sont incompressibles, alors que les gaz oui, le gaz

va être comprimé, le débit ne sera plus constant et le temps de rétention va changer. On ne peut plus identifier l’espèce recherchée.

è Pompes Dans l’appareillage, il y au moins une pompe débimétrique (elle force le passage de la MP au travers de la colonne repliée de PM). Le passage de PM s’accompagne d’une pression. Le débit est stable et non pulsé à un ou 2 pistons. Les pompes à 2 pistons fonctionnent en opposition. Par exemple, le piston A aspire PM pendant que le piston B expulse PM vers la colonne. Le piston en amont refoule 2 fois plus le solvant que le piston en aval. L’éluant dans le piston B est envoyé dans la colonne pendant que le piston A aspire l’éluant. Ensuite, le piston A refoule l’éluant, dont la moitié vient remplir le piston B, ce qui règle le débit. Les vannes en amont et en aval sont là pour permettre l’aspiration de l’éluant, et bloquer son retour.

La présence de gaz (N2, O2, CO2) dans la PM peut générer des bulles, c’est-à-dire des variations de pressions, il faut donc dégazer les PM. Dans le mode isocratique, la composition de la PM est fixe, elle ne change pas. Dans le mode de gradient d’élution, la composition de la PM est variable. Au niveau de la pompe à basse pression, on a 2 solvants qui vont être mélangés dans la chambre de mélange, si la pompe est après la chambre de mélange, alors la pompe est de basse pression. Au niveau de la pompe à haute pression, on a aussi 2 solvants, cependant les pompes sont avant la

chambre des mélanges, alors la pompe sera de haute pression. Les solvants ont chacun leurs pompes. Après la pompe, les solvants vont se mélanger dans la chambre des mélanges. è Injecteurs Les injecteurs ont 2 positions, il a la position de chargement, il s’agit de la communication uniquement entre la pompe et la colonne. L’échantillon introduit à PA à l’aide d’une seringue dans un petit volume appelé boucle. La seringue va servir à prélever l’échantillon qui va atterrir dans la boucle, le volume est constant et connu. L’échantillon reste dans la boucle, il ne va pas dans la colonne. La boucle est reliée à l’extérieur de 1 à 4. Dans la position injection, le liquide va dans la colonne, la PM passe de 2 à 1 dans la boucle et va donc dans la colonne. Elle entraine tout le volume de la boucle dans la colonne, mais le volume est toujours constant. On va donc basculer par la vanne d’injection, la PM pousse le volume de l’échantillon dans la colonne. C’est donc une injection ou introduction d’un liquide dans le flux de la PM par rotation de 60° d’un levier qui permet d’inverser le sens de circulation dans la boucle. Pour une bonne reproductibilité, il faut remplir la boucle totalement par un excès d’échantillon. Le volume injecté est 5 à 10 fois supérieur à celui de la boucle. Avant injection, les solutions d’échantillon sont filtrées (0,45𝜇m). è Colonnes Ce sont des tubes étroits en acier mesurant entre 3 et 30cm de longueur. La DI est de 4,6mm avec un débit de 0,5-2 mL/min. La PS (petites particules solides) maintenue entre 2 disques poreux, situés aux extrémités et de volume mort aussi petits que possible. è Les phases stationnaires La PS (petites particules solides) est au contact de la PM, mais insoluble dans celle-ci. Il y a un 2ème milieu, avec lequel les analytes initialement dissous dans la PM vont aussi interagir. ->Les gels de Silice Il s’agit d’un solide amorphe et rigide de formule SiO2(H2O)n (avec n très proche de 0) est utilisé dans 80% des applications. Il est présent sous forme de microsphères poreuses ou non, d’un diamètre très régulier (3 à 10 𝜇m) assurent un remplissage homogène dans la colonne. Il y a donc un agencement tétraédrique des 4 liaisons autour de l’atome de Si.

La préparation se fait par un procédé dit sol-gel en émulsion d’un alcoxysilane : 1) Formation de très petites particules par hydrolyse basique. 2) Sphères de diamètre final de quelques micromètres via différents processus. La nature du processus d’interaction repose sur l’adsorption, elle peut être décrite comme l’accumulation d’un composé à l’interface de deux phases, ici PM et PS.

L’adsorption monocouche, idéalement mais aussi adsorption multicouche (attraction avec les anaytes déjà adsorbés) qui peut générer une non-symétrie des pics d’élution.

La chromatographie de phase normale possède une PS polaire constitué d’un gel de Si. Nature du processus d’interaction repose sur l’adsorption (peut être décrite comme l’accumulation d’un composé à l’interface de deux phases, ici PM et PS). La silice est un matériau très polaire, du fait de la présence de fonctions silanol. Les fonctions silanol ont des propriétés acidobasiques (pka = 3).

On peut obtenir une bonne qualité d’un gel de silice, ce sont les matériaux de base pour le remplissage des colonnes : - Structure interne, - Taille de billes, - Porosité ouverte correspondant à la taille et la répartition des pores (10 nm), - Surface spécifique (4-350 m2/g), -

Résistance à l’écrasement, Polarité (5 SiOH/μm2)

->Les silices greffées Les gels de silice peu utilisés à l’état natif (SiOH). On a pu observer une évolution au cours du temps (manque de reproductibilité) et polarité excessive. Pour diminuer la polarité on utilise la réactivité des fonctions silanol à la surface de la silice pour immobiliser, par des liaisons covalentes, des molécules organiques. Le gel de silice ainsi greffée devient assimilable à un liquide, et la séparation met en jeu des coefficients departage et non plus des coefficients d’adsorption. Ces PS greffées sont à l’origine de la chromatographie de partage à polarité de phase inversée. La polarité peut facilement être ajustée selon la nature des espèces organiques greffées.

Il existe 2 types de phases : - Les phases monomères, c’est une réaction, en milieu basique, d’un monochlorosilane avec les silanols de surface

-

Les phases polymères, c’est une réaction avec un di- ou trichlorosilane en présence de vapeur d’eau, provoquant la polymérisation du silane avant greffage sur la silice.

Ces 2 types de phases sont utilisables dans une gamme de pH allant de 2 à 10....