L2 S4 Chromatographie Enoncé TD 2021 2022 PDF

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Université Paris-Est Créteil (UPEC) UE Chromatographie Année 2021-2022 Licence Sciences et Technologie (L2 Chimie-Chimie Bio-Parcours International) CONSIGNES TP : Les TPs ont lieu en salle 209 du bâtiment P4. La durée des TP est de 4 ½ heures, les horaires sont précisés sur l’emploi du temps mis en ligne sur le site ADE de l’UPEC. Le compte-rendu est à rendre à la fin de la séance. La blouse est obligatoire et les étudiants sans blouse ne seront pas acceptés en salle de TP. Les retards seront sanctionnés. L’utilisation du téléphone est interdite. Tout changement de groupe doit-être demandé au préalable ([email protected]). Seules les demandes justifiées seront acceptées. Tout étudiant absent à un TP doit fournir un justificatif et demander à rattraper le TP, sinon l’étudiant aura une note de zéro au TP. EXERCICE 1 : On mélange dans un erlenmeyer 6 ml de gel de silice (phase stationnaire) et 40 mL d’un solvant (phase mobile) contenant en solution 100 mg d’un composé non volatil. Après agitation, on laisse décanter et on recueille 10 mL du solvant que l’on évapore. Le résidu pèse 12 mg. Calculer le coefficient d’adsorption K = CS/CM de ce composé. EXERCICE 2 : L’analyse par chromatographie d’un mélange contenant 4 composés a conduit au chromatogramme présenté page 2. Le premier signal (non numéroté) correspond aux solutés non retenus contenus dans le mélange (tm=1,2 min). Le temps de rétention du soluté 4 est indiqué sur le chromatogramme (t4=22,9 min). On donne : débit D=0,5 mL/min ; longueur de la colonne : L= 25 cm On rappelle la formule : N=5,54 tR2/t2 1-Déterminer le temps de rétention (min) puis le volume de rétention (mL) de chaque soluté. 2-Déterminer le volume mort (mL) de la colonne. 3-Déterminer le facteur de rétention du soluté 4. 4-Déterminer (en utilisant 2 formules différentes) le nombre de plateaux théoriques de la colonne en considérant le pic du soluté 1, puis en considérant le pic du soluté 4. 5-Déterminer la hauteur équivalente à un plateau théorique (pic 1 et pic 4). 6-Déterminer le facteur de résolution entre les solutés 2 et 3. Conclure sur la qualité de la séparation. 7-Déterminer la vitesse linéaire de la phase mobile. 8-Déterminer la vitesse linéaire du soluté 4. La valeur obtenue vous parait-elle logique ? EXERCICE 3 (facultatif) : On injecte un mélange de 2 solutés A et B sur une colonne de chromatographie (colonne 1) de longueur L1=10 cm et de diamètre dc1=0,5cm, débit = 1 mL/min. La vitesse linéaire de la phase mobile est égale à 0,15 cm/sec. Les facteurs de rétention des 2 solutés sont respectivement égaux à 0,8 et 1,27. Le nombre de plateaux théoriques de la colonne 1 est égal à 340. 1-a Déterminez le volume mort de la colonne, le volume de rétention de chaque soluté. L’exprimer en mL , et la valeur du facteur de résolution R 1 entre les deux pics. La séparation est-elle correcte ? On injecte le même mélange sur une autre colonne (colonne 2) de longueur L2=2L 1=20 cm. Toutes les autres conditions chromatographiques sont maintenues constantes. 2-a. Donnez l’expression littérale du volume de rétention V2 d’un soluté sur la colonne 2 en fonction de son volume de rétention V1 sur la colonne 1, de L 2 et de L1. Justifiez votre réponse. 2-b. Donnez l’expression littérale de la largeur du pic à la base ω2 d’un soluté sur la colonne 2 en fonction de sa largeur de pic à la base ω1 sur la colonne 1, de L2 et de L1. Justifiez votre réponse. 2-c. Donnez l’expression littérale du facteur de résolution R 2 entre les 2 pics en fonction de R1, de L 2 et de L 1. Faites l’application numérique. Que peut-on conclure sur la qualité de la séparation ? EXERCICE 4 : On cherche à doser par CLHP l’héroïne contenue dans une poudre. 1- Dans un premier temps, on prépare trois solutions étalon d’héroïne en dissolvant respectivement 5 mg (solution 1), 10 mg (solution 2) et 20 mg (solution 3) d’héroïne dans 100mL de méthanol. On injecte 20 µL de chaque solution étalon sur la colonne et on note l’aire du pic correspondant (t R= 7 min) (résultats reportés dans le tableau 1). Solution étalon 1 2 3 Tableau 1 * u.a ; = unité arbitraire Aire du pic (u.a.)* 25 100 49 000 100 000

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Université Paris-Est Créteil (UPEC) UE Chromatographie Année 2021-2022 Licence Sciences et Technologie (L2 Chimie-Chimie Bio-Parcours International) Tracer la courbe étalon donnant l’aire du pic en fonction de la concentration massique de la solution étalon (en mg/L). 2-Dans un deuxième temps, on prélève 100 mg d’échantillon (poudre) que l’on dissout dans 50 mL de méthanol (solution X). Après filtration, on injecte 20 µL de cette solution inconnue sur la colonne. On obtient quatre pics principaux. Les résultats sont reportés dans le tableau 2. pic 1 pic 2 pic 3 pic 4 Tableau 2 tR (min) 0,9 2,7 7,05 9 Aire (u.a.) 120 000 12 000 163 000 19 500 Après obtention de ces résultats, on décide de diluer la solution inconnue au ½ avec du méthanol. On injecte 20 µL de la solution diluée (solution X’) sur la colonne. Les résultats sont reportés dans le tableau 3. pic 1 pic 2 pic 3 pic 4 Tableau 3 tR (min) 0,91 2,7 7 9,1 Aire (u.a.) 61 000 6 010 81 000 9 720 2-a. Pourquoi a-t-on dilué la solution X au 1/2 ? 2-b. Déterminer la concentration massique de l’héroïne dans la solution X. 2-c. En déduire le pourcentage massique d’héroïne dans la poudre. EXERCICE 5 : 1-Vous essayez de séparer un mélange inconnu par chromatographie en phase inverse avec un éluant 50% acetonitrile/50% H 2O. Les pics obtenus sur le chromatogramme se chevauchent et sont élués dans le domaine k’=2-4. Pour améliorer la séparation de ce mélange, utiliseriez-vous une plus forte ou plus faible concentration en acetonitrile ? 2-Vous essayez de séparer de nouveau un mélange inconnu sur phase normale avec comme éluant : 50% hexane/ 50% methyl t-butyl ether. Les pics se chevauchent avec un k’ compris entre 2 et 4. Pour améliorer la séparation de ce mélange, utiliseriez-vous une plus forte ou plus faible concentration d’hexane ? EXERCICE 6 : On se propose de séparer du décan-1,4-ol et du décane par chromatographie à polarité de phase inversée (colonne remplie de silice octadécyle; L=15 cm; dc=0,5 cm; volume mort V m=1,4 ml). Les phases mobiles utilisées sont constituées de mélanges eau-acétonitrile. L'évolution des facteurs de rétention k' 1 et k'2 en fonction du pourcentage d'eau de la phase mobile est reportée dans le tableau ci-dessous (les indices 1 et 2correspondent aux pics 1 et 2). % eau

10

20

30

40

k'1

1,35

2

2,75

3,8

k'2 1,86 3,86 7,94 17,4 1- Quel est le soluté élué en première position, le décan-1,4-ol ou le décane ? Pourquoi ? 2-Tracez pour chaque soluté les courbes log k' = f(%eau). 3- a) Expliquez la position relative des deux courbes. 3-b) Dans le cas du décane, justifiez la valeur positive de la pente. Pourquoi les pentes ont-elles des valeurs différentes ? 3-c) Le décan-1,4-ol possède deux fonctions alcool. D'après les résultats chromatographiques obtenus, le décan-1,4-ol a-t-il un caractère polaire ou apolaire ? 4- Sachant que le nombre de plateaux théoriques de la colonne est égal à 400 pour les deux solutés), quelle phase mobile devra-t-on utiliser pour obtenir une séparation correcte (facteur de résolution supérieur ou égal à 1,5)? EXERCICE 7 : (Facultatif) On cherche à séparer deux acides carboxyliques par chromatographie à polarité de phase inversée : l’acide propanoïque noté R 1-COOH et l’acide pentanoïque noté R2-COOH. On utilise une colonne de silice greffée en C18 de longueur L égale à 15 cm (Vm=1,4 ml) et une phase mobile composée d'un mélange de tampon phosphate 0,01 M de pH égal à 7 et d'acétonitrile dans les proportions 50-50 (v/v). Le débit D est fixé à 0,5 ml/min. 1- Les volumes d'élution dans ces conditions sont respectivement égaux à V 1=1,4 ml et V 2=1,5 ml. Expliquez ce résultat. 2- On modifie donc la phase mobile en y ajoutant du chlorure de tétrabutylammonium de concentration égale à 5.10 -3 mol.l-1 sans en modifier le pH. On observe alors sur le chromatogramme deux pics très bien séparés (R=3) de volumes d'élution égaux à V' 1=5,2 ml et V'2=7,8 ml. Expliquez ce résultat et identifiez les pics.

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Université Paris-Est Créteil (UPEC) UE Chromatographie Année 2021-2022 Licence Sciences et Technologie (L2 Chimie-Chimie Bio-Parcours International) 3- Calculez la durée exacte de l'analyse. 4- On cherche à diminuer la durée de l'analyse. Devra-t-on augmenter ou diminuer le pourcentage d'acétonitrile dans la phase mobile ? Pourquoi ? 5- Proposez d'autres méthodes permettant de réduire la durée de l'analyse. EXERCICE 8 : (Facultatif) 1-Des composés aromatiques non polaires sont séparés par CLHP. La phase stationnaire est une phase inverse C18 constituée de greffons de chaînes aliphatiques à 18 carbones. L’éluant utilisé est un mélange 65% méthanol / 35% H 2O. Comment les temps de rétention seraient-ils modifiés en utilisant un mélange avec 90% de méthanol ? 2-Deux composés, l’acide octanoïque et le 1-aminooctane, sont analysés sur la même colonne CLHP décrite en (1) et en utilisant comme éluent un mélange 20% méthanol / 80% tampon (pH 3.0). Lequel des deux composés sera élué en premier ? Pourquoi ? CH3CH2CH2CH 2CH2CH2CH 2COOH acide octanoïque CH3CH2CH2CH 2CH2CH2CH 2CH2NH2 1-aminooctane EXERCICE 9 : On cherche à analyser un mélange contenant des ions Ca2+, Na+ et K+ sur une colonne de chromatographie d’échange d’ions (L=25 cm). On rappelle les numéros atomiques de ces éléments : Ca : Z=20 ; Na : Z=11 ; K : Z=19. La phase mobile est à base d’acide nitrique (H+NO3-) dilué. 1- Préciser le type de support chromatographique qu’il convient d’utiliser : un support portant des groupements sulfonate (-SO3-) ou ammonium quaternaire (-NR3+) ? Justifier ce choix 2- Dans le cas des ions Na+, écrire l’équilibre d’échange d’ions entre le soluté, la phase stationnaire et la phase mobile. 3- Dans quel ordre les ions Ca2+, Na+ et K+ seront-ils élués ? Justifier la réponse. 4- Lorsque la concentration de l’acide nitrique contenu dans la phase mobile est égale à 10-3M, les pics sont très bien séparés (R>>1,5) mais la durée de l’analyse est élevée (>30 minutes). Pour réduire le volume de rétention des solutés (et donc la durée de l’analyse), faut-il augmenter ou diminuer la concentration de l’acide nitrique contenu dans la phase mobile ? Justifier clairement la réponse. (On pourra, par exemple, raisonner sur le cas des ions Na+). EXERCICE 10 : (Facultatif) 1- On cherche à séparer par chromatographie d’échange d’ions un mélange contenant trois protéines : le lysozyme (pI=11), l’ovalbumine (pI de 4,5 à 5) et la conalbumine (pI=6,7). La phase stationnaire est à base de silice poreuse recouverte d’une pellicule de polymère échangeur d’anions. La longueur de la colonne est de 10 cm. Le volume mort est égal à 0,9 mL. La phase mobile est à base de tampon phosphate (20 mM) e de chlorure de sodium (0,2 M) ; pH = 7,4. Dans ces conditions on observe trois pics à 0,92 mL(pic 1), 2,8 mL (pic 2) et 3,4 mL (pic 3). a- Justifiez le choix du pH de la phase mobile et identifiez les pics. b- Si on appelle Z le nombre de charges accessibles portées par le lysozyme dans ces conditions chromatographiques, écrire l’équilibre d’échange entre cette protéine, la phase stationnaire et la phase mobile. c- Dans ces conditions d’analyse, le facteur de résolution entre les pics 2 et 3 est égal à 0,9. Afin d’améliorer la séparation, on se propose de modifier la concentration du sel dans la phase mobile. Faudra-t-il augmenter ou diminuer la concentration du NaCl ? Expliquer. 2-Tracez l’allure d u chromatogramme que l’on aurait obtenu sur une colonne échangeuse de cations (même phase mobile que précédemment). Justifiez l’allure de ce chromatogramme. EXERCICE 11 : La partie gauche de la figure ci-dessous représente les pics obtenus après injection d’échantillons de polysaccharides (pullulanes) de masse molaire connue sur trois colonnes de chromatographie d’exclusion stérique PL aquagel OH mixed placées en série (dimensions de chaque colonne 300x7,5 mm). Les masses moléculaires M des standards injectés sont égales à 788 000, 212 000, 47 300, 11 800 et 667 g/mole. Le débit de la phase mobile (tampon phosphate pH 7,0 additionné de nitrate d’ammonium 0,2M) est de 1 mL/min. 1-Tracer la courbe de calibration log M = f (Ve) obtenue avec les standards de polysaccharides. 2- Déterminer la masse molaire de l’échantillon de pectine (polysacharide carboxylé) dont le chromatogramme est présenté sur la partie droite de la figure.

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EXERCICE 12 : (Facultatif) Les chromatogrammes présentés ci-après correspondent à la séparation d'un mélange de cinq protéines par chromatographie d'interaction hydrophobe sur une colonne "TSK Phenyl": le cytochrome C (pic 1), la myoglobine (pic 2), la ribonucléase A (pic 3), le lysozyme (pic 4) et la ferritine (pic 5). Les conditions d'élution sont : Eluant A: tampon phosphate 50 mM; pH=7 ; Eluant B: tampon phosphate 50 mM + (NH4)2SO4 à 2 mol.l-1; pH=7 -chromatogramme 1 : gradient linéaire de 50% de B à 10% de B en 60 min. -chromatogramme 2 : gradient linéaire de 100% de B à 10% de B en 60 min. 1- Classer les cinq protéines ci-dessus, par ordre décroissant d’hydrophobie. 2- Expliquer les différences constatées entre les deux chromatogrammes. (volumes d'élution, qualité de la séparation etc...).

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Université Paris-Est Créteil (UPEC) UE Chromatographie Année 2021-2022 Licence Sciences et Technologie (L2 Chimie-Chimie Bio-Parcours International) Exercice 13 : L’analyse d’un mélange injecté dans une colonne capillaire WCOT a donné le chromatogramme ci‐dessous. Caractéristiques de la colonne : L=10m, dc=0,18mm, ef=20 μm; Conditions opératoires: Gaz vecteur : H2, débit de sortie colonne : 0,7 ml/mn, Pe 1.3 bar, Ps: 1 bar ; Détecteur : FID ; Température du four : 30°C. 1‐ Après avoir rappelé le principe de la chromatographie en phase gazeuse et calculé la perte de charge de la colonne ci‐dessus, expliquer son effet sur l’efficacité de la colonne. Quel serait l’effet d’une perte de charge 10 fois plus grande ? 2‐ Sachant que le pic n°1 est celui du méthane, calculer les facteurs de rétention k’ des composés numérotés 8 et 10 et la résolution du couple 7 et 8. Comment peut‐on l’améliorer ? 3‐ Calculer le débit moyen (ml/min) de la colonne et comparer le à celui donné dans les conditions opératoires.

Exercice 14 : (Facultatif) En CPG à 60°C, on veut séparer deux isomères sur une colonne remplie de phase stationnaire faiblement polaire de 2m de longueur. L’analyse est conduite avec la vitesse optimale d’hélium à 20 cm/sec. On obtient les facteurs de rétention kʹ suivants : kʹ2‐méthylpentane = 4 et kʹn‐hexane =4,4 1‐Calculer le nombre de plateaux théoriques de la colonne sachant la résolution entre les deux pics est de 1,5. 2‐Calculer le temps d’analyse. 3‐La courbe de Van Deemter montre qu ’au-dessus de la vitesse optimale de la phase mobile (u >uopt), on a la relation suivante : H= (2/3) x (Hopt/uopt) x u. Que deviennent la résolution et le temps d’analyse, si on augmente la vitesse du gaz vecteur à 60 cm/s ? 4‐ Quelle est la longueur de la colonne qui serait nécessaire pour maintenir la même résolution de 1,5 entre les 2 pics à cette vitesse linéaire de 60 cm/sec ? Quel serait dans ce cas le temps d’analyse ?

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