Chromatographie CM4 - L2 CB-SVT S4 PDF

Preview

Summary

CHROMATOGRAPHIECM->Les silices greffées Les phases greffées pour la CPI, ce sont des grains recouverts d’une fine couche de paraff ine. En c hromatographie, on observe ce qui est différent. Dans les 2 structures, ce qui diffère est le groupement H et le CH3. La RP18, signifie « reversed phase ». ...

Description

CHROMATOGRAPHIE CM4 ->Les silices greffées Les phases greffées pour la CPI, ce sont des grains recouverts d’une fine couche de paraffine. En chromatographie, on observe ce qui est différent. Dans les 2 structures, ce qui diffère est le groupement H et le CH3. La RP18, signifie « reversed phase ». Ici, la PM doit être polaire. C’est CH3 qui est le plus apolaire. C’est la molécule de la caféine est plus soluble dans la PS, elle sera donc plus retenue. Le petit pic de gauche est la théobromine, et le pic à droite est la caféine.

A coté des phases comportant des chaînes linéaires alkyle à 8 ou 18 atomes de carbone, utilisables de pH 2 à 10, il existe d’autres types de phases : - Les groupements aminopropyle sont polaires et peuvent être positif dans un pH acide - Les groupements cyanopropyle sont polaires aprotiques - Les groupements benzyle sont apolaires et des donneurs d’électrons - Les phases mixtes sont des mélanges de ces différents groupements

è Les phases mobiles Il existe des interactions entre PM et PS déterminent la rétention. En se basant sur la polarité de la PS, on distingue : - PS est polaire : chromatographie dite de phase normale (adsorption), on utilisera une PM peu polaire (mélange hexane isopropanol) - PS est très peu polaire : chromatographie dite à polarité de phase inversée – ou chromatographie hydrophobe – on utilisera une PM polaire (mélanges eau ou acétonitrile avec l’eau). Une modification de la composition de la PM entraine en modifiant la composition de la PM, on agit sur K (CS/CM, le coefficient de distribution) et donc sur k’ (facteur de rétention). Il faut donc faire le bon choix de la nature des solutés à séparer. Si on compare les ordres d’élution obtenus avec les PS à polarité de phase inversée et PS normales, on obtient des ordres d’élution opposés. ->Choix de la PM : cas des phases normales (adsorbant polaire et très polaire) Avec un éluant polaire, un composé polaire migre plus vite qu’un composé apolaire. Avec un composé apolaire, un composé apolaire migre plus vite qu’un composé polaire. Pour réduire le temps de rétention, et donc les temps (couts) d’analyse, on effectue un gradient d’élution. La viscosité et donc la pression en tête de colonne varie avec la composition.

Si le mélange est plus visqueux, la pression est différente. La PS génère la rétention.

è La chromatographie d’appariement d’ions Appelée PIC pour Paired Ion Chromatography, cela permet d’améliorer la séparation des composés ioniques ou très polaires ayant peu d’affinité avec les PS apolaires. Pour augmenter la rétention, il faut diminuer le caractère ionique en : - Diminuant le pH, pas toujours possible - Ajoutant dans la PM d’un composé porteur à la fois d’une chaîne carbonée (peu polaire) et d’un groupement de charge opposée à celle du composé à séparer (alkylammonium pour les solutés négatifs ou alkylsulfonate pour les solutés positifs). Il en résulte une paire d’ions, globalement neutre, assez stable et lipophile, c’est-à-dire qui sera retenue sur une PS à polarité de phase inversée.

Ici, on sépare l’ATP, l’ADP et l’AMP, l’analyse se fait sur la RP18, les 18 sont 18C qui sont greffés sur la Si. Quand on analyse avec la tétrabutylammonium, on obtient un ordre d’élution inversée. L’ATP est plus polaire que l’AMP, l’ATP sera moins retenue et se dissoudra moins dans la PS, elle sera éluée en premier. La PM ne modifie pas les ordres d’élution, mais elle change l’ordre de polarité. Ici, on va donc comparer ce qui change, le groupement P est une structure polaire. Quand on a un groupement P, la molécule va être apolaire. On transmet l’échantillon dans une colonne de C18 (apolaire), les espèces apolaires sont retenues et vont être éluées en dernier. Dans le 2ème cas, plus on a de groupement P, plus on a de groupement C et donc plus la

molécule est apolaire. L’ATP est la molécule la plus apolaire, car elle contient 3 groupements de C. è Chromatographie d’interaction hydrophobe Appelée HIC pour Hydrophobic Interaction Chromatography, elle permet la séparation de composés bioorganiques tels que les protéines solubles dans l’eau. On sélectionne une PS apolaire, et on démarre l’élution avec une PM fortement saline (Sulfate d’ammonium 2M et phosphate monosodique 0,1 M, à pH 7). Dans des conditions fortement salines, les protéines se fixent par leurs domaines hydrophobes sur la PS. Ensuite, on diminue progressivement la concentration saline, afin que les protéines repassent dans la PM. L’ordre d’élution des protéines se fait en fonction de leur caractère hydrophobe, les protéines sont ainsi éluées dans l’ordre décroissant de leur caractère hydrophile.

La colonne contient 2 PM de RP18. Le A est riche en sel, et le B est moins riche en sel. Même s’ils ont des concentration salines différentes, ces 2 phases possèdent le même pH. Les protéines vont adsorber sur la PS.

è Les principaux détecteurs Les principaux détecteurs sont utiles pour déterminer la composition totale d’un échantillon et/ou pour déterminer la teneur en un des constituants du mélange. Les aires relatives des pics d’un chromatogramme n’ont souvent aucun rapport avec la composition massique ou molaire du mélange analysé.

Un détecteur doit : - Donner pour chaque composé une réponse proportionnelle à sa concentration instantanée, - Être sensible, - Avoir peu de bruit de fond, - Être stable dans le temps ->Détecteurs spectrophotométriques La détection est basée sur la loi de Beer-Lambert :

L’absorbance A, de la PM est mesurée en sortie de colonne, à la longueur d’onde l (ou à plusieurs longueurs d’onde) dans l’UV ou le visible.

L’intensité de l’absorption dépend du coefficient d’absorption molaire, εl, ce qui rend impossible le calcul des concentrations des espèces détectées par une mesure directe des aires des pics. La PM ne doit pas, ou peu, absorber par elle même. C’est un détection sélective, les composés qui ne possèdent pas de spectre d’absorption exploitable, nécessite une étape de dérivations.

La source au deutérium ou à vapeur de mercure. Le monochromateur permet d’isoler une bande passante étroite (10 nm) ou une raie (254 nm pour la raie du Hg). La cellule à circulation possède un volume de quelques μL avec un trajet optique de 0,1 à 1 cm au travers de laquelle circule la PM contenant l’échantillon. Pour terminer, nous avons le moyen de détection optique (photomultiplicateur ou photodiode). Détection polychromatique : Les détecteurs plus perfectionnés permettant soit : - De changer de longueur durant l’analyse, - D’enregistrer l’absorbance à plusieurs longueurs d’onde simultanément, - D’enregistrer tout un domaine de longueurs d’onde sans interrompre la circulation dans la colonne.

Une source polychromatique dans le proche UV/Vis éclaire la cellule de mesure. La lumière transmise par l’échantillon est dispersée par un réseau à réflexion sur le détecteur constitué de diodes (jusque plusieurs 100aines). Chacune indique l’absorbance moyenne sur un intervalle très étroit de longueur d’onde (1 nm).

Détecteurs spectrofluorométriques : Les composés fluorescents réémettent sous forme de lumière tout ou partie du rayonnement de la source lumineuse auquel ils sont soumis. L’intensité de fluorescence est proportionnelle à la concentration de la substance, si elle est faible. Détecteur très sensible et sélectif (aux produits fluorescents). En pratique, la fluorescence est mesurée dans une direction perpendiculaire à celle de l’excitation. Les détecteurs peuvent être élargis par dérivation des analytes qui peut être réalisés pré- ou post-colonne. L’intensité de fluorescence varie fortement d’un composé à l’autre, pour obtenir une réponse optimale certains détecteurs peuvent être programmés.

Détecteurs réfractométriques : Un faisceau (mono ou polychromatique) traverse une cellule comportant deux compartiments dont l’un est rempli avec de l’éluant seul et l’autre avec la PM en sortie de colonne. Le principe repose sur la loi de Fresnel de transmission de la lumière dans les milieux transparents dont l’indice de réfraction est n. La différence d’indice de réfraction entre les deux liquides, qui apparait lorsqu’un soluté est élué, entraine un déplacement angulaire du rayon réfracté.

Pratiquement, le signal correspond à la mesure en continu de la rétroaction qu’il faut fournir à un élément optique pour compenser le déplacement du faisceau réfléchi.

Figure 1 : mélange de sucres...