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Chromatographie Zusammenfassung...

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Zusammenfassung Chromatographie Nach der Vorlesung von Dr. Keusgen und Rücker, Neugebauer, Willems (als Nachschlagewerk) Gegenstandskatalog Chromatographie:

Definition Als Chromatographie werden physikalische Methoden bezeichnet, bei denen eine STOFFTRENNUNG durch VERTEILUNG zwischen einer RUHENDEN (stationären) und einer sich BEWEGENDEN (mobilen) Phase erfolgt. Diese können Feststoffe, Flüssigkeiten oder Gase sein. Die stationäre Phase ist meist fest, die mobile Phase wird an der stationären vorbeigeführt. Der gelöste Stoff in der mobilen Phase verteilt sich auf der Stationären. Ein chromatographisches System besteht aus zwei NICHT MITEINANDER MISCHBAREN Phasen, von denen sich die eine an der anderen vorbei bewegt Geschichte Tswett Martin, Synge Cremer Golay Stahl Verschiedene: Dandenau Seit Seit Seit

1902 1941 1951 1957 1960 1970 1970 1980 1985 1990

Russischer Botaniker (SC)  Blätterfarbstoff Verteilungschromatographie erster Gaschromatograph (GC) „Backofen mit Trennsäule“ Kapillar-Gaschromatographie Dünnschichtchromatographie (DC) (phytochemische Analytik) Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) Fused Silica Kapillare (GC) Miniaturisierung und EDV-Steuerung aller Techniken (PC-Nutzung) Chromatographie mit überkritischen Fluiden (SFC) Kapillarelektrophorese, mizellare elektrokinetische Chromatographie Wurde mit Peleusball betrieben Zu 1: Parallelbetreibung von 5 Röhren (Parallelanalyse) Zu 2: durchgelaufener Pflanzenextrakt wird in Säule in verschiedene Banden aufgeteilt, über dem Röhrchen befindet sich ein Flüssigkeitsreservoir Zu 4: Bei der Unterdruckmethode wird es so verwendet (90° gedreht)

Phasenkombinationen Mobile Phase Flüssig Flüssig (flüssig)  super critical* Gasförmig gasförmig *SFC  flüssiges CO2

Stationäre Phase Fest Flüssig Flüssig Fest flüssig

Technik PC, DC, SC DCCC (PC, DC, SC) SFC GC (GSC) GC (GLC)

Planare Techniken: PC, DC (TLC), HPTLC (High Performance Thin Layer Chromatography) Säulenchromatographie: SC (CC), MPLC (medium Pressure), HPLC (High Pressure/Performance), SFC Gaschromatographie: GSC (Säulen), GLC (Liquid), HRGC (High Resolution)

Säulenchromatographie Einteilungen:

Analytische Trennungen  Labor Prinzip: Substanzmischung wird auf die Säule aufgebracht, mobile Phase wird draufgegeben. Kieselgel wird meist als stationäre Phase verwendet. Die physikalischen Eigenschaften der Stoffe sorgen für die Aufteilung (Fraktionierung) 1 = Säule 2 = LM Reservoir 3 = Pumpe 4 = Detektor 5 = Injektionsventil nach der Pumpe Betrieb der Säule von unten nach oben, wegen hydrostatischem Druck

Anwendungsbeispiele:  Isolierung von Naturstoffen  Reinigung von chemischen Stoffen  Identitätsprüfung  Reinheitsprüfung Arzneibuch!  Quantifizierung (Gehalt)  Untersuchung von Ausgangsstoffen und FAM (Herstellung, Improzess/Qualitätskontrolle)  Forschung und Entwicklung (Synthesekontrolle, Strukturaufklärung, Isolierung Naturstoffe)  Untersuchung von AS bei der Anwendung (Pharmakokinetik, Drug-Monitoring)  Toxikologie, forensische Chemie (Missbrauch, Vergiftungen, Suchtstoffe, Blutalkohol)  Umweltanalytik, Arbeitsmedizin (Wasser, Abwasser, Müll, Luft (MAK)) (Vermerk: MAK steht im Skript ist aber eigentlich veraltet, nach Rechtslage gilt mittlerweile der AGW)

Chromatographisches Grundprinzip: Die Wechselwirkung zwischen Analysensubstanz einerseits und mobiler und stationärer Phase andererseits erfolgt in einer Vielzahl aufeinanderfolgender Einzelschritte: „Multiple Wechselwirkungen“ Je häufiger die Wechselwirkungen stattfinden, desto besser das Trennergebnis. Verteilungschromatographie (seltener): Phänomen der Stoffverteilung zwischen zwei nicht mischbaren Phasen. Die stationäre Phase ist hierbei eine mit LM gesättigte feste Phase (Silica, Papier), die mobile Phase ist der Eluent. Adsorptionschromatographie (häufiger): Phänomen der Stoffverteilung zwischen zwei nicht mischbaren Phasen. Die stationäre Phase ist hierbei eine feste Phase mit zumeist großer OF (Silica), die mobile Phase ist der Eluent. Der Analyt kann mit der OF der stationären Phase in WW treten und adsorbiert werden. Physikalische Adsorption (schwach)  Reversibel (GG Adsorption-Desorption)  Adsorptionsenthalpien: 2-10 kcal/mol  Van der Waals Kräfte Chemische Adsorption (Chemisorption, stark)  Häufig irreversible (nur geeignet für ABtrennung von Störstoffen, nicht wünschenswert für AUFtrennung)  Adsorptionsenthalpien 20-150 kcal/mol  Bindungsähnliche Zustände

ES KOMMT AUF EINE EXAKTE ABSTIMMUNG ZWISCHEN DER STATIONÄREN UND DER MOBILEN PHASE AN!

Begriffe: Phasen: Sorbens: Retention:

zwei nicht miteinander mischbare Stoffe (Rücker) feste stationäre Phasen (Rücker) verzögerter Durchfluss von einzelnen Substanzen des Substanzgemisches der mobilen Phase durch Wechselwirkung mit der stationären Phase (Elution: Herauslösen oder Verdrängen von adsorbierten Stoffen aus festen oder mit Flüssigkeit getränkten Adsorbentien und Ionenaustauschern durch kontinuierliche Zugabe eines Lösungsmittels) Elutionsstärke: Maß der Fähigkeit der Elution einer mobilen Phase Polare Phasen: partiell geladene Moleküle mit Dipolmoment zweier nicht miteinander mischbarer Stoffe (mobil und stationär) Unpolare Phasen: ungeladene Moleküle zweier nicht miteinander mischbarer Stoffe (mobil und stationär) Polare Substanzen: partiell geladene Moleküle mit Dipolmoment der Probe Unpolare Substanzen: ungeladene Moleküle der Probe Polare LM: partiell geladene Moleküle mit Dipolmoment der mobilen Phase Unpolare LM: Moleküle der mobilen Phase (außer die mit Rücker gekennzeichneten Begriffe sind alles aus WIKI zusammengebastelte Definitionen weil der Rücker (2. Auflage 1992) diese nicht als Definition führt)

Die Berechnung von Trennsystemen ist zum heutigen Zeitp. nicht möglich  nur Erfahrungswerte

1) SPÄTE ELUTION LANGE RETENTIONSZEIT und 3) Laufstrecke umso weiter je polarer das LM 2) FRÜHE ELUTION KURZE RETENTIONSZEIT und 4) Laufstrecke umso kürzer je unpolarer LM Bsp.: Kieselgel in EtOH  SiOH hat alkoholische Funktion  polare OF  H-Brücken möglich  polare Substanzen haften gut  Analyt haftet Stark, kann nur mit satrker mobiler Phase abgelöst werden (EtOH/MetOH) Apolare Sbst. Interagieren nur schwach lipophiles LM Phase normal

Umkehr Reversed Phase (RP)

Sorbens hydrophil

Retention Polare Sbst Stark 1

lipophil

Alkohole, Carbonsren, Amine, Aldehyde schwach

Elutionsstärke Polare LM Hoch 3

Unpolare LM Gering 4

Vitamine, Arzneistoffe, Antimykotika

EtOH usw.

Hexan usw.

stark

Gering (H2O)

Hoch (Methanol/ Acetonitril)

Unpolare Sbst Schwach 2

Bei sehr polaren Stoffen (z.B. ASS)  Säurefunktion  starke Haftung  keine C möglich RP Kieselgel wird apolar gemacht mit Dichlorsilan Keine 100%ige Reaktion, wegen C18-Alkylgruppen  sterische Hinderung, dann Dimethylchorsilan zum verethern der restlichen SiOH = Endcapping Säulenmaterial vor allem bei RP mit LM konditionieren bevor man C macht!

Bei allen C ist die richtige Abstimmung von Polarität, LM, Substanz und Sorbens sehr wichtig!

Elutrope Reihe der Lösungsmittel

Zu Lösungsmitteltemperatur: LM muss abgedampft werden, je tiefer Siedetemperatur desto einfacher. Zu UVCutoff: Ab diesem Wert kann detektiert werden (mobile Phase darf nicht selbst absorbieren, wo das Präparat absorbiert). Zu Viskosität: wichtig für Druckeinstellung, höher je höher die Viskosität.

Ionenpaarchromatographie Ionenpaare sind lipophile Verbindungen aus jeweils einem Kation und Anion, die in einem Elutionsmittel weitgehend undissoziiert vorliegen.

Beispiele:

 Vor allem für Säuren und Basen, über mobile Phase wird Gegenion zugegeben  nach außen liegt ungeladenes Molekül vor; AB Methode bei Alkaloiden

Ionen(austausch)chromatographie

(nicht verwechseln!!!)

Ionen werden vom UV-Detektor nicht erfasst! Sie werden anders detektiert, zunächst kommt ein Kationen- bzw. Anionenaustauscher zum Einsatz. Diese sind relativ schwach (Trennsäule). Kationenaustauscher verwendet man zur Bestimmung von Kationen, Anionenaustauscher für Anionen.

Größenausschlusschromatographie Partikel der stationären Phase sind große organische Moleküle mit poröser Struktur. Sie haben bestimmte Porengrößen in denen Partikel mechanisch (physikalisch) festgehalten werden. Wird verwendet bei Makromolekülen: Proteine, Zucker, RNA, DNA

 Retentionszeit Umgekehrt proportional zur Molekülgröße  zur größeneinschätzung von Molekülen

Chromatogramme

 Bei Substanzgemisch: mehrere Peaks  muss mit Standards gearbeitet werden – Vergleich mit Probe

Optimierung der Auflösung Rs  Optimierung der Trennleistung (Peakbreite)  Physikalische Maßnahmen (Korngröße, Säulenlänge, Elutionsmittelgeschwindigkeit  Optimierung der Selektivität (Peakabstand)  Chemische Modifikationen (andere LM, andere stationäre Phase)  Optimierung der Retention (verändertes Mischungsverhältnis des Elutionsmittels (veränderte Polarität), veränderte Temperatur (GC))

Beispielaufgabe: Bestimmen sie Trennstufenzahl, Trennfaktor, k´-Werte und Auflösung:

Auflösung:

Trennstufenzahl 1: n= 5,54 * (3,5/0,6)2 = 188,5138 Trennstufenzahl 2: n= 5,54 * (5,45/0,8)2= 257,1123 Trennfaktor : α=5,8125/3,375= 1,72 (k´2/k´1) Kapazitätsverhältnis 1: 2,7/0,8= 3,375 Kapazitätsverhältnis 2: 4,65/0,8 = 5,8125 Auflösung: 1,18* (5,45-3,5/0,8+0,6) = 1,18* (1,95/1,4) = 1,64 (Anmerkung: Da alle Werte recht klein sind, liegt bei diesem Graphen keine gute Trennung vor!) Angaben der Rechnungen ohne Gewähr!

HPLC – High Performance Liquid Chromatography

Spülventil zum Entlüften, Pumpkolben aus Saphir, Dichtungen aus Saphir- oder Rubinringen

Beliebte Prüfungsfrage!!!

Dünnschichtchromatographie (DC, TLC) Beeinflussende Faktoren  Auswahl des Trennsystems: Platte, Sorbens, Kammer, Elutionsmittel  Auftragen der Substanz  Entwicklung: vertikal, horizontal  Detektion: UV-Licht, Farbreagenzien  Auswertung, Dokumentation  Stationäre Phasen: Aluminiumoxid, Cellulose, chemisch modifizierte Phasen: RP-2, RP-8, CN, DIOL, NH2, Kieselgel (auch silanisiert), Kieselgur, Polyamid, Magnesiumsilikat Chromatographieplatten sind Einmalplatten

 gehen auch als Mikro-DC

Geeignete DC-Fließsysteme

Grundreaktion:

Mechanismus (Klausur?!):

Quelle: Wikipedia Gaschromatographie (GC) Voraussetzungen:  Substanzen müssen sich unzersetzt verdampfen lassen (müssen gasförmig stabil sein) o Lipophil, MG bis ca. 550 o Hydrophile Substanzen können derivatisiert werden  GC – HRGC (high resolution GC) o Mobile Phase Gas (Trägergas): N2, H2, He  GSC (gas-solid-chromatography); stationäre Phase: fest (Trennprinzip: Adsorption)  GLC (gas-liquid-chromatography); stationäre Phase: flüssig (Trennprinzip: Verteilung)

Beispiele(Muster):

Direkte Kopplung von Trennverfahren mit spektroskopischen Methoden

Validierung von Analyseverfahren Präzision: Richtigkeit:

Maß für den Grad der Reproduzierbarkeit der Analysenergebnisse (zufällige Fehler) gibt Abweichung des Mittelwertes der Bestimmungen vom wahren Wert an (systematischer Fehler)  z. B.: ungeeichte Waage

Nachweisgrenze:

Bestimmungsgrenze:

Empfindlichkeit:

für qualitative Analysen Gibt die niedrigste Masse oder Konzentration einer Substanz an, die mit dem Verfahren noch zuverlässig nachgewiesen werden kann. Sie kann durch das Signal/Rauschverhältnis definiert werden. für quantitative Analysen Niedrigste Masse oder Konzentration, die mit dem Analyseverfahren noch mit akzeptabler Präzision und Richtigkeit bestimmt werden kann. Liegt meistens bei dem 2-3 fachen Wert der Nachweisgrenze. Beschreibt, wie stark ein Messergebnis auf Konzentrationsveränderungen reagiert. Bei Linearität entspricht sie der Steigung der Kalibriergeraden.

Quantitative Analyse – Standardadditionsverfahren Der Name des Verfahrens bezieht sich auf das Hinzufügen eines Standards (bzw. Analyt) zur Analysenprobe. Beim Standard-Additionsverfahren wird jeder Probe mehrmals eine bestimmte Menge Analyt hinzugefügt und die Probe wird nach jeder Zugabe gemessen. Dabei wird der Zuwachs des Analytsignals bestimmt. Durch lineare Regression kann die Konzentration des Analyten in der ursprünglichen Probe berechnet werden. (WIKI)

(Blutzuckermessung & den Rest hat er nicht mehr gemacht und auf Elektrochemie verschoben.)...