TP BSF1-HPLC, chromatographie liquide haute performance PDF

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Summary

Contre rendu du TP HPLC, ainsi que des questions supplémentaires...

Description

TP: Détermination du site actif d’un peptide synthétique par HPLC

I.

But

Le but du TP est de déterminer la localisation du site d'interaction d’un peptide synthétique avec l’héparine (un glycosaminoglycane naturel). Pour cela nous allons faire une chromatographie en phase inverse avec appariement des ions en HPLC. Ensuite nous ferons une chromatographie d’affinité et une HPLC pour déterminer quelle fraction du peptide contient le site de fixation à l’héparine.

II.

Principes

a) Chromatographie en phase inversée (RPC) avec appariement d’ions : C’est une chromatographie liquide de partage. Elle est utilisée pour l’analyse quantitative, qualitative, et pour la purification des petites molécules et peptides. Cette séparation dépend de l’adsorption réversible de molécules selon la polarité. La phase stationnaire est hydrophobe tandis que la phase mobile est polaire. La phase stationnaire est composée d’une plaque de silice sur laquelle est greffée une chaîne aliphatique en C8. La phase mobile est composée d’un liquide polaire (eau). Ainsi, les composés apolaires seront retenus, et les polaires sortiront en premier. Un composé est retenu d’autant plus longtemps sur la phase stationnaire que sa polarité est faible. La composition de la phase mobile peut être fixe (isocratique) ou non. Nous allons utiliser la méthode de gradient d’élution, c'est-à-dire que le solvant sera modifié au cours de l’analyse. Il deviendra plus apolaire afin d’éluer les composés les plus apolaires. L’augmentation progressive d'acétonitrile permet d’éluer les composés polaires dans un premier temps, et ensuite les composés de plus en plus apolaires retenus initialement dans la colonne. Cette chromatographie est pratiquement toujours utilisée avec un appariement d’ion. Ici nous sommes servi du TFA (acide trifluoroacétique) pour former des paires d’ions globalement neutre. Cet ion compensateur possède à la fois des molécules chargées négativement et un caractère légèrement hydrophobe. Il permet également de fixer les peptides basiques sur la phase hydrophobe.

b) HPLC (High Performance Liquid Chromatography): C’est une technique qui peut s’appliquer à différents types de chromatographie (partage, affinité, exclusion-diffusion). Le pouvoir de séparation est amélioré grâce à des colonnes hautes résolution

(TR réduits), d’une matrice incompressible, d’une pompe à haute pression qui pousse la phase mobile (gain de temps d’analyse). La phase stationnaire a une fine granulométrie homogène ce qui permet une haute sensibilité (dosage de petite quantité), et une meilleure séparation des composants. Pour un même volume de phase stationnaire, la surface d’échange augmente si les billes sont de plus petits diamètres. La finesse des particules augmentent l'efficacité de la colonne mais aussi la résistance au passage du solvant. C’est pour cela qu’on utilise des pompes à haute pression, le débit d’écoulement de la phase mobile est plus rapide. On aura donc des temps de rétention plus court.

Schéma d’une chaîne d’HPLC

III.

Conditions opératoires

- Colonne: phase stationnaire composée de silice greffée avec des chaînes de 8 atomes de carbones (C8); porosité 300 angström, granulométrie 7 microns, dimension de la colonne 3 cm x 2.1 mm.

- Phase mobile: débit constant de 1 ml/min avec un gradient linéaire d’acétonitrile en TFA 0.1 % ➢ Solution A composé de TFA 0.1 % dans de l’eau ➢ Solution B composé acétonitrile 90 % et de TFA 0.1 %

- Programme de gradient: ➢ Conditions initiales: 95 % de A (5 % de B), étape de fixation ➢ En 12 minutes, aller à 30 % de B (70 % de A), étape de séparation ➢ En 2 minutes, revenir à 5 % de B (95 % de A), étape de remise en conditions initiales.

- Détection à une longueur d’onde: 214 nm. Normalement nous choisissons une longueur d’onde de 280 nm afin de détecter les acides aminés aromatiques. Ici notre peptide n’est composé que d’un

acide aminé aromatique: la phénylalanine. En se plaçant à 214 nm on peut alors détecter tous les acides aminés mais également les impuretés comme le tampon, le DTT...

- Nature et volume d’injection: ➢ ➢ ➢ ➢

Blanc: 500 µl de tampon Nacl Peptide non digéré: 250 µl Peptide digéré: 150 µl Peptide digéré par chromatographie d’affinité: 350 µl = fraction retenu sur l’héparine + la fraction non retenu

- Rôles des produits utilisés: ➢ Solvant A et B: permettent l’élution des molécule polaire, en créant un gradient de polarité. ➢ TFA (acide trifluoroacétique) : c’est un ion compensateur. Le TFA est un acide fort, son rôle est de réduire le caractère ionique des peptides. Étant chargé négativement il va interagir avec les peptides basiques et les rendre neutres, il permet de les greffer sur la phase hydrophobe. Il aide à la solubilisation des peptides ou des protéines difficiles. ➢ Tampon NaCl, Tris-HCl : le tampon 0.15 M permet d’équilibrer la colonne et a un effet contreion. Le tampon 1 M permet l’élution de la fraction peptidique liée à l’héparine. On utilise un tampon à pH 7.4 pour éviter la dégradation du peptide à cause d’une variation de pH. Ce pH est proche du pH physiologique. ➢ DTT ( dithiothréitol): Agent réducteur qui en présence de chaleur va dénaturer l’enzyme de façon irréversible. Il va rompre les ponts disulfures. ➢ PMSF (fluorure de phénylméthylesulfuryle): C’est un inhibiteur de protéase à sérine. Il va donc inhiber l’activité de l’a-chymotrypsine. ➢ a-chymotrypsine: c’est une enzyme de restriction (endoprotéase à sérine) qui hydrolyse les liaisons après un acide aminé volumineux. Plus précisément après les aromatiques (T, W, F). Elle va couper notre peptide en deux, car il ne possède qu’un acide aminé aromatique: la phénylalanine. Séquence de notre peptide: AVELRSPGISRFRRKIAKRSIKTLEHKRENAKE ➢ Acétonitrile : Il est présent dans le solvant B, son rôle est de diminuer la polarité de la phase mobile, tandis que le pourcentage du solvant B augmente.

IV.

Résultats a. Chromatogramme 1 : injection “blanche” en HPLC

Cette injection est utilisée afin de détecter d’éventuels pics artéfactuels. Nous avons un pic à 0.737 min qui correspond au temps d’injection de notre tampon. Après notre injection, on remarque une légère perturbation de l’appareil. Nous n’avons pas d'autre pic donc pas d’impuretés.

b. Chromatogramme 2 : peptide non digéré

Sur ce chromatogramme obtenu en HPLC, nous observons un pic à un Tr = 0.683 min, il correspond à l’injection de notre peptide non digéré. Ensuite il a une perturbation normal causer par les injections des groupes précédant (le temps que l’appareil se stabilise)

Le deuxième pic au Tr= 9.419 min, correspond au peptide non digéré.

c. Chromatogramme 3 : injection du peptide digéré par l ’�-chymotrypsine

Le premier pic au temps de rétention de 0.501 min correspond à l’injection du peptide digéré avec le DTT. Le DTT est très polaire (composé de OH et de SH), il va donc traverser la colonne et sortir en premier. Le deuxième pic à un temps de rétention de 1.550 min, il s'agit du PMSF qui possède un cycle aromatique. Il va donc interagir avec la phase stationnaire. Il est légèrement retenu et sort donc un peu après le DTT. Notre peptide qui a été digéré par la a-chymotrypsine est divisé en 2 fragments:

AVELRSPGISRF/ RRKIAKRSIKTLEHKRENAKE Fragment 1

coupure

fragment 2

acide aminé= apolaire, hydrophobe La a-chymotrypsine coupe après les acides aminés aromatiques, ici il n’y a que la phénylalanine, donc on obtient que deux fragments. Le fragment 1 possède plus d’acides aminés hydrophobes, il sera donc retenu plus longtemps par la phase stationnaire. C’est donc le fragment 2 qui sera élué en premier. Ces deux fragments non pas la même polarité donc pas les mêmes temps de rétention. Le troisième pic à un temps de rétention de 5.176 min correspond au fragment 2 du peptide qui a été digéré par la a-chymotrypsine, il possède plus d’acides aminés polaires, et sera donc élué plus rapidement.

Le quatrième pic à un temps de rétention de Tr= 7.266 min correspond au fragment 1 du peptide. Il possède plus d’acides aminés hydrophobes, il va plus interagir avec la phase stationnaire. Le cinquième pic à un temps de rétention de Tr= 9.506 min correspond à notre peptide non digéré. Il reste une petite quantité de celui-ci qui n’a pas subi l’hydrolyse.

d. Chromatogramme 4 : fraction retenu par l’héparine obtenu par injection en HPLC après chromatographie d’affinité Après la chromatographie d’affinité sur le gel d’héparine-sepharose, on récupère le filtrat et on l’injecte en HPLC. Le filtrat correspond au fragment qui interagit avec l’héparine, et qui se fixe sur la phase stationnaire. L’autre fragment sera éliminé et récupéré, c’est la fraction non retenu.

Le 1er pic au temps de rétention de 0.542 min correspond à l’injection avec le DTT, ce pic est moins grand que les précédents car il a été éliminé lors du lavage. Il doit rester quelques résidus. Le 2ème pic au temps de rétention de 1.696 min représente le PMSF. Le 3ème pic au temps de rétention de 5.151 min correspond à notre fragment retenu par l’héparine. Le temps de rétention est égale au Tr du fragment 2. C’est donc la seconde partie du peptide qui possède le site d’interaction avec le glycosaminoglycane. Cependant nous observons également des pics au temps de rétention de 7.376 min et 9.525 min. L’un correspond au fragment non retenu (le fragment 1) et l’autre est notre peptide non digéré. Leur présence est sûrement dû à un mauvais rinçage du gel de la chromatographie.

e. Chromatogramme 5: fraction non retenu par l’héparine obtenu par injection en HPLC après chromatographie d’affinité

Le 1er pic avec un Tr= 0.676 min correspond à l’injection avec le DTT. Le 2ème pic avec un Tr= 1.691 min correspond au PMSF. Le 3ème pic avec un temps de rétention de 5.344 min correspond au fragment 2, moins apolaire qui est élué en premier. Le 4ème pic avec un temps de rétention de 7.179 min correspond au fragment 1 car il a le même temps de rétention trouvé précédemment. C’est la fraction qui n’a pas été retenue par l’héparine.

V.

Conclusion

Le but de ce TP était de préciser la localisation du site d’interaction d’un peptide synthétique connu avec un glycosaminoglycane, ici l'héparine par HPLC en phase inverse avec appariement d’ions. Après l’étude de nos chromatogrammes, nous savons que le peptide digéré par la a-chymotrypsine donne 2 fragments différents. Le fragment 1 avec 7 acides aminés hydrophobes et le fragment 2 avec 5 acides aminés hydrophobes. C’est donc le fragment 1 qui sera élué en dernier au Tr= 7.266 min, car il a plus d’affinité avec la phase stationnaire. Après analyse de la fraction retenu sur la chromatographie d’affinité, on trouve un temps de rétention égale au Tr du fragment 2. Nous pouvons donc en conclure que l’interaction entre le peptide et l’héparine se réalise au niveau de la partie C-terminale du peptide, sur le fragment 2, située après la Phénylalanine.

VI.

Annexes

1) Les principales propriétés des solvants choisis pour la phase mobile sont: ➢ ➢ ➢ ➢ ➢ ➢

pas absorber à 214 nm pour ne pas être détecté sur les chromatographies être suffisamment fluide pour pouvoir s'écouler dans la colonne et les capillaires pas interagir avec la phase stationnaire filtré pour éliminer d’éventuelles particules dégazer pour éviter que les bulles d’air bouleversent le support dans la colonne miscibilités des solvants A et B entre eux, afin de créer un gradient

2) Afin de connaître le pourcentage de B, nous pouvons définir son équation de droite:

y=ax+b

avec : y = % solvant B au temps t x = temps t d’analyse en minute b = pourcentage de solvant B à t = 0 min

A t=0 min A t= 12 min

a=

Y1 = 5 = a x 0 +b Y2 = 30= a x 12 + b

Y 2−Y 1 30−5 =¿ = X 2−X 1 12 −0

2.08

Donc b= 30 - (2.08 x 12)= 5.04 L’équation permettant de connaître à tout moment le gradient de pourcentage de B est:

y= 2.08 x X + 5.04 Fragment 2= fraction retenue:

Tr= 5.176 min y= 2.08 x 5.176 + 5.04= 15.81 % Il faut 15.81 % d’acétonitrile dans le solvant B pour éluer le fragment 2. Fragment 1= fraction non retenue:

Tr= 7.266 min y= 2.08 x 7.266 + 5.04= 20.15 % d’acétonitrile dans le solvant Il faut 20.15 % d’acétonitrile dans le solvant B pour éluer le fragment 1.

3)

1. 2. 3. 4. 5. 6.

mettre la vanne en position LOAD rincer trois fois la seringue avec du tampon remplir la seringue avec la solution, éviter les bulles d’air insérer l’aiguille dans le trou prévu pour cet effet injecter lentement la solution laisser la seringue enfoncer et mettre la vanne sur inject, au même moment appuyer sur run méthode du logiciel 7. une fois terminé retirez l’aiguille

4) L'héparine est chargée négativement et peut donc interagir avec d’autres ions. Le NaCl 0.15M va permettre un effet “contre-ion” sur l’héparine qui va se lier avec les Na+. Il joue un rôle d'équilibration car il se rapproche des conditions physiologiques iso-osmotique - isotonique. Le NaCl 1M a une concentration élevée en sel et permet d'éluder les déchets. Et donc d’éviter des pics fantômes....