Kelompok 1 Modul 4 PDF

Preview

Summary

LAPORAN PRAKTIKUM ANALISIS FARMASI SEMESTER GANJIL 2018 - 2019 Pemeriksaan Kadar Metabolit Sekunder Ekstrak Psidium Guajava Hari / Jam Praktikum : Senin / 07.00 – 10.00 WIB Tanggal Praktikum : 12 November 2018 Kelompok :1 Asisten : 1. Alda Anjella Lady C.P.A. 2. Yolanda Pertiwi LABORATORIUM ANALISIS...

Description

LAPORAN PRAKTIKUM ANALISIS FARMASI SEMESTER GANJIL 2018 - 2019

Pemeriksaan Kadar Metabolit Sekunder Ekstrak Psidium Guajava Hari / Jam Praktikum

: Senin / 07.00 – 10.00 WIB

Tanggal Praktikum

: 12 November 2018

Kelompok

:1

Asisten

: 1. Alda Anjella Lady C.P.A. 2. Yolanda Pertiwi

LABORATORIUM ANALISIS FARMASI FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN JATINANGOR 2018

I. Tujuan Memeriksa kadar flavonoid total ekstrak sebagai kuersetin dan menentukan kadar kuersetin

II. Prinsip 2.1 Kolorimetri Metode kolorimetri merupakan suatu metode analisis kimia berdasarkan perbandingan perbedaan warna antara larutan sampel dengan warna larutan bakunya (Basset, 1991). 2.2 Adsorpsi Adsorpsi merupakan proses interaksi antara molekul yang bergerak dengan molekul yang diam dimana terjadi proses penyerapan molekul yang bergerak pada molekul yang diam yang memiliki permukaan atau antar muka (Sukarjo, 1990). 2.3 Partisi Partisi adalah suatu proses pemisahan komponen tertentu pada suatu senyawa yang berprinsip, yaitu distribusi zat yang terlarut terhadap 2 pelarut yang tidak bercampur (Marselia et al, 2015).

2.4 Hukum Lambert Beer Hukum Lambert Beer merupakan prinsip yang digunakan oleh spektofotometri demgam primsip jumlah seluruh radiasi visible, Ultraviolet dan cahaya-cahaya lain yang ditransmisikan oleh suatu larutan merupakan suatu fungsi eksponen dari konsentrasi zat dan tebal larutan. A = abc Ket : A = absorbansi

` a = molar absorptivity dalam L/(mole)(cm) b = panjang kuvet dalam cm c = komsemtraso sampel (mol/L) (Neldawati et al, 2013)

III. Reaksi

IV. Teori Dasar Ekstrak merupakan sediaan kental yang berasal dari hasil ekstraksi senyawa aktif dari simplisia nabati ataupun hewani dengan menggunakan pelarut yang sesuai. Kemudian semua atau hampir seluruh pelarut diuapkan dan massa yang tersisa diperlakukan sedemikian rupa hingga didapatkan hasil baku yang telah ditentukan (Depkes RI,1995). Ekstrak sebagai bahan dan produk kefarmasian berasal dari simplisia yang telah memenuhi standard an persyaratan yang berlaku untuk dijadikan obat herbal terstandar atau fitofarmaka. Parameter mutu ekstrak yang penting adalah kandungan senyawa aktifnya. Selain itu ada pula parameter spesifik dan non spesifik yang digunakan dalan standardisasi mutu (Niazi et al,2010). Adapun karakterisasi simplisisa yaitu penetapan kadar abu, kadar abu larut air, kadar abu tidak larut asam,kadar sari larut asam,kadar sari larut air

dan kadar air secara destilasi . Selain itu untuk karakteristik ekstrak terdiri dari karakteristik non spesifik yang meliputi bobot jenis,kadar air, kadar sisa pelarut dan kadar abu. Sedangkan karakterisasi spesifik mencakup pemeriksaan senyawa yang terlarut dalam pelarut air dan etanol, pola kromatogram pada plat KLT-densitometri. Pemeriksaan golongan kimia ekstrak dari penetapan kadar menggunakan spektrofotometer sinar ultar violet (UV) (Ani dan Arifin ,2006). Kandungan abu pada ekstrak atau simplisia tergantung pada macam bahan dan proses pengabuannya. Kandungan abu berhubungan dengan kandungan mineral suatu bahan. Ada dua macam garam mineral,yaitu organik misalnya garam dari asam malat,oksalat,asetat,pektat dan lainnya dan adanya garam-garam anorganik moisalnya fosfat, karbonat,klorida,sulfat nitrat dan logam alkali (Sudarmadji,1989). Pada parameter bobot jenis dapat mengindikasikan spesifikasi ekstrak uji. Parameter ini penting Karena bobot jenis ekstrak bergantung pada jumlah serta jenis komponen atau zat terlarut didalamnya (Ditjen POM,2000). Abu merupakan residu anorganik yang didapat dengan cara mengabukan komponen-komponen organik. Jumlah dan komposisi abu dalam mineral tergantung pada jenis nbahan serta metode analisis yang digunakan. Cara pengabuan secara lansung yaitu mengoksidasi semua zat organik pada suhu tinggi sekitar 500-600 C dan dilakukan penimbangan zat yang tertinggal pada proses pembakaran tersebut hingga bobotnya konstan (Sudarmadji,1989). Bobot jenis suatu zat adalah perbandignan antara bobot zat dan volume pada suhu tertenut sedangkan rapat jenis adalah perbandignan antara bobot jenis suatu zat dengan bobot jenis air pada suhu tertentu. Beberapa alat untuk mengukurnya

yaitu

piknometer,

nercara

air,ndan

neraca

Reimann

(Martin,1990). Flavonoid merupakan salah satu senyawa antioksidan golongan fenolik alam yang terbesar dan terdapat dalam hampir semua tumbuhan, sehingga dapat dipastikan terdapat flavonoid pada setiap telaah ekstrak tumbuhan.

Flavonoid merupakan salah satu golongan senyawa yang terbukti dapat digunakan sebagai antioksidan, antikanker, dan anti depresan (Azizah et al,2014). Uji parameter spesifik kadar total golongan kandungan kimia bertujuan untuk memberikan informasi kadar kandungan golongan kimia sebagai parameter mutu ekstrak dalam kaitannya dengan efek farmakologis (Depkes RI,2000). Dalam farmakope,metode spektrofotometri Uv-Vis digunakan untuk menetapkan kadar senyawa obat dalam jumlah yang cukup banyak. Spektroskopi serapan ultraviolet dan serapan sinar tampak merupakan cara tunggal yang paling berguna untuk analisis flavonoid dan fenolik (Markham,1988). Spektofotometer Uv-Vis menyelidiki interaksi radiasi sinar cahaya dengan materi pada sinar ultraviolet dengan panjang gelombang 200-400 nm dan sinar tampak dengan panjang gelombang 400-800 nm (Adeeyinwo,2013). Spektrum flavonoid biasanya ditentukan dalam larutan dengan pelarut methanol atau etanol. Spektrum khas flavonoid terdiri atas dua maksimal rentang 230-293 nm (pita II) dan 300-360 nm (pita I) (Neldawati,2013). Uji parameter spesifik pola kromatografi bertujuan untuk memberikan gambaran awal komposisi kandungan kimia berdasarkan pola kromatogram. Didalam isolasi senyawa, kromatografi sangat penting dan fundamental untuk identifikasi,deteksi pemisahan , deteksi optimal fase gerak, deteksi kemurnian,dll. KLT akan memvisualisasikan senyawa-senyawa yang terkandung dalam bahan sehingga bisa diketahui sifat-sifat terutama polaritas (Saifudin,2014). Sebagai pembanding dapat digunakan kuersetin yang merupakan flavonoid golongan flavonol yang mempunyai gugus keto pada C-4 dan memiliki gugus hidroksi pada atom C-3 atau C-5 yang bertetangga dari flavon dan flavonol. KLT menggunakan fase stasioner berupa lapisan tipis suatu adsorben,misalnya gel silica dilapiskan pada pelat dan fase mobilnya adalah

berupa campuran pelarut. Sampel diaplikasikan pada plat kemudian plat diberdirikan dengan ujung bawah dengan pelarut. Ketika pelarut naik akibat aksi kapiler pada adsorben, komponen sampel terbawa dengan kecepatan yang berbeda, dapat dilihat sebagai

deretan titik- titik setelah platnya

dikeringkan/diwarnai/dilihat dibawa UV (Sumawinta,2002).

V. Alat dan Bahan 5.1 Alat a. Chamber Kromatografi Lapis Tipis

f. Pipet tetes g. Pipet Volume

b. Gelas Kimia

h. Plat Silica Gel

c. Gelas Ukur

i. Sentrifugator

d. Kertas Saring

j. Spektrofotometer UV-Vis

e. Labu Ukur

k. Tabung Sentrifugasi

5.2 Bahan a. AlCl3

g. Ekstrak Kental Psidii Folium

b. Amona

h. Etanol

c. Aquadest

i. Kalium Asetat

d. Asam Asetat

j. Kuersetin

e. Baku Asam Galat

k. N-Butanol

f. Baku Rutin

VI. Prosedur Pada praktikum yang telah dilaksanakan, Hal pertama yang dilakukan adalah dibuatnya larutan uji ekstrak dengan ditimbangnya ekstrak sebanyak 1 gram, lalu dilarutakan ekstrak kedalam 25 ml larutan etanol 95%. Campuran dari ekstrak dan etanol kemudian di masukan kedalam tabung sentrifugasi, lalu di sentrifugasi selama 3 jam dengan kecepatan 200 rpm. Setelah disentrifugasi

diambil bagian supernatan dari sampel yang kemdian ditambahkan etanol hingga 25 ml . Langkah kedua adalah dibuatnya larutan stock kuersetin. Larutan baku kuestein di buat dengan ditimbangnya kuersetin dan dilarutkan kuersetin kedalam etanol 97%, Hasil akhirnya didapatkan larutan baku kersetin sebanyak 1000 ppm. Langkah ketiga adalah pembuatan kurva baku. Hal yang dilakukan dalam pembuatan kurba baku adalah dibuatnya larutan kersetin dalam etanol dalam berbagai konsentrasi yaitu 40,60,80,100,120 μg/mL ( ppm),Kemudian dari setiap konsentrasi diambil 0,5 ml dan dicampur dengan 1,5 ml etanol 95% : 0,1 ml Aluminium Klorida 10%:0,1 ml Natrium Asetat : dan 2,8 ml Aquadest. Lalu campuran tersebut diinkubasi pada suhu kamar selama 30 menit.Serapan diukur dalam spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang maksimun yaitu 429 nm dan dibuat kurva baku standar sesuai dengan pengamatan. Langkah Keempat adalah pengujian kuantitaif kadungan kersetin dalam ekstrak. Langkah awal pada pengujian ini adalah diambilnya larutan sampel dalam etanol sebanayk 0,5 kemudian ditambahkan dengan 1,5 ml etanol 95% : 0,1 ml Aluminium Klorida 10%:0, 1ml Natrium Asetat : dan 2,8 ml Aquadest. Campuran tersebut diinkubasi selama 30 menit pada suhu kamar. Selanjutnya serapan diukur dengan sektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang maksimun 429 nm . Jumlah Flavonoid diukur dengan metode kolorimetri aluminium Klorida. Selanjutnya dilakukan penentuan flavonoid dari larutan uji ekstrak secara kualitatif dengan mengunaan metode Kromatografi Lapis Tipis. Pertama-tama larutan ekstrak dan arutan aku berupa kuersetin, Asam Galat dan Rutin ditotolkan masing-masing 1 cm diatas Plat Silica gel. Setelah itu Plat dimasukan kedalam Chamber yang berisi eluen berupa 40 ml N-Butanol : 10 ml Asam Asetat: 50 ml Air (4:1:5) yang terlebih dahulu sudah dijenuhkan. Kemudian plat dikeringkan dan diamati dibawah sinar UV 254 nm. Nilai Rf sampel dihitung dan dibandingkan dengan Rf Standar .

VII. Data Pengamatan No. Perlakuan

Hasil

Pembuatan Ekstrak Etanol 1.

Menimbang 1 g simplisia dan

Didapatkan larutan ekstrak simplisia

melarutkan ke dalam 25 ml etanol 2.

3.

Mengocok dengan magnetic

Didapatkan ekstrak yang memisah

stirrer selama 8 jam

dari pelarutnya

Menyaring campuran dan

Didapatkan filtra ekstrak dengan

mengambil filtratnya dan

volume 25 ml

menambah etanol 95% hingga 25 ml Pembuatan Kurva Kalibrasi 1.

2.

Membuat larutan kuersertin

Didapatkan larutan kuerserin dengan

dengan konsentrasi 40, 60, 80,

konsentrasi 40, 60, 80, 100, dan 120

100, dan 120 µg

µg

Mengambil 0.5 ml dari masing-

Diapatkan campuran yang akan

masing konsentrasi dan

diinkubasi.

menambahkan 1.5 ml etanol 95%; 0.1 ml AlCl3 10%; 0.1 ml natrium asetat I M, dan 2.8 ml aquadest 3.

Inkubasi pada suhu kamar selama

Didapatkan larutan yang sudah di

30 menit. Amati serapannya pada

inkubasi dan serapannya telah

348 nm

teramati

Penentuan Jumlah Flavonoid 1.

0.5 ml larutan ekstrak

Didapatkan kadar flavonoid sebesar

diperlakukan sama seperti

0.108 %

apdabaku kuersertin dan hitung kadar flavonoidnya Pengujian kualitatif kandungan kuersetin dalam ekstrak

1.

Menotolkan larutan ekstrak dan

Didapatkan KLT yang telah

baku kuersertin masing-masing 1

ditotolkan ekstrak

cm di atas plat KLT 2.

Mengembangkan plat dalam

Fase gerak telah didapatkan dengan

chamber yang mengandung 200

perbandingan 4:1:5 antara campuran

ml campuran n-butanol, asam

n-butanol, asam asetat, dan air

asetat, dan air (4:1:5). 3.

Mengeringkan plat, amati di

Plat telah teramati

bawah sinar UV 4.

Menghitung Rf sampel dan

Didapatkan harga Rf sebesar 0.25

membandingkan dengan yang standar

VIII. Grafik dan Perhitungan 8.1 Pembuatan AlCl3 10 𝑥 = 100 100 𝑚𝑙 X = 1 gram

8.2 Pembuatan Natrium Asetosal 𝑚

M = 𝑚𝑟 =

1 𝑉

𝑚

1 = 82,03 =

1 10

M = 820,3 gram

8.3 Pengenceran Kurva Baku (1000 ppm) 

120 ppm 1000 .V1 = 120. 10 V = 1,2 ml



100 ppm

120 .V1 = 100. 10 V = 8,33 ml 

80 ppm 100 .V1 = 80. 10 V = 8 ml



60 ppm 80 .V1 = 60. 10 V = 7,5 ml



40 ppm 60 .V1 = 40. 10 V = 6,67ml

8.4 Pembuatan kurva baku Kuersetin

Persamaan y = 0,0076 x- 0,0432 R2 = 0,9991

8.5 Perhitungan Kadar Flavonoid Total Sampel I Y = 0,0076 x – 0,0432 0,405 = 0,0076 x – 0,0432 0,405+ 0,0432 = 0,0076 x 0,4482 = 0,0076 x 0,4482

X = 0,0076 = 58,97 ppm

Sampel II Y = 0,0076 x – 0,0432 0,471 = 0,0076 x – 0,0432 0,471+ 0,0432 = 0,0076 x 0,5142 = 0,0076 x

0,5412

X = 0,0076 = 71,21 ppm Sampel III Y = 0,0076 x – 0,0432 0,226 = 0,0076 x – 0,0432 0,226+ 0,0432 = 0,0076 x 0,2692 = 0,0076 x 0,2692

X = 0,0076 = 35,42 ppm

Rata-Rata =

58,97+71,21+35,42 3

= 55,2 ppm

8.6 Kadar Flavonoid F= F=

𝐶 𝑥 𝑉 𝑋 𝑃 𝑋 10−6 𝑋 100 % 𝑚 55,2 𝑥 25 𝑥 1 𝑥 10−6 𝑥 100% 1,2772

= 0,108%

8.7 Perhitungan Rf Rf Pembanding Rutin =

4,6 6

= 0,767

Asam Galat = Kuersetin =

0 6

5,7 6

= 0 = 0,95

Rf Sampel Ekstrak Jambu Biji =

1,5 6

= 0,25

IX. Pembahasan Pada praktikum ini dilakukan pemeriksaan kadar flavonoid total sebagai kuersetin, lalu ada rutin dan asam galat. Pemeriksaan ini penting dilakukan untuk ekstrak yang akan digunakan sebagai bahan baku sediaan farmasi tradisional. Kuersetin seperti yang telah diketahui merupakan senyawa marker pada daun jambu biji. Dalam sediaan, kuersetin berperan sebagai zat aktif yang memberikan efek farmakologis. Sebagai zat aktif, tentunya kuersetin harus dipastikan keberadaannya dalam ekstrak daun jambu biji. Pemastian ini disebut sebagai analisis kualitatif. Pemeriksaan keberadaan kuersetin bisa dilakukan dengan menggunakan kromatografi lapis tipis. Selain dipastikan keberadaannya, kuersetin juga harus diperiksa kadarnya. Pemeriksaan kadar ini dikarenakan sediaan farmasi tentunya berhubungan dengan dosis. Jika tidak diketahui kadar kuersetin dalam ekstrak, maka penentuan dosis tidak dapat dilakukan. Selain itu, penentuan kadar juga dapat menjadi syarat spesifik dari ekstrak. Penentuan kadar kuersetin dalam ekstrak daun jambu biji dilakukan dengan metode kolorimetri. Sebelum dilakukan pengujian, baik dengan KLT maupun dengan kolorimetri, dilakukan preparasi sampel terlebih dahulu. Sampel yang merupakan ekstrak daun jambu biji ditimbang dan dilarutkan dalam etanol. Hal ini karena ekstrak larut dalam etanol dan tidak larut dalam air. Etanol yang digunakan juga etanol dengan kadar tinggi yaitu 96%. Hal ini karena etanol dengan kadar tinggi berpotensi tinggi pula untuk mengambil senyawa aktif dari ekstrak. Agar senyawa aktif lebih dapat ditarik dari ekstrak, maka terlebih dahulu dilakukan sentrifugasi selama jam. Selain sampel, bahan lain yang perlu dipreparasi adalah larutan kuersetin baku. Larutan kuersetin baku berfungsi sebagai pembanding. Larutan ini digunakan baik dalam KLT untuk mengetahui Rf kuersetin, maupun dalam kolorimetri untuk membuat kurva baku kuersetin, dimana kurva baku ini akan memberikan persamaan yang bisa dipakai untuk menghitung kadar kuersetin. Metode KLT yang dilakukan bertujuan untuk mengetahui adanya kuersetin, rutin, asam galat dalam ekstrak daun jambu biji. Caranya adalah

dengan membandingkan waktu retensi sampel atau ekstrak dengan waktu retensi dari kuersetin baku. Pada KLT ini dibutuhkan eluen atau fasa gerak dan fasa diam. Untuk eluen digunakan n-butanol : asam asetat : air dengan perbandingan 4 : 1 : 5. Sementara itu untuk fasa diam digunakan silika gel. Alasan dari penggunaan metode KLT adalah karena metode ini memiliki kelebihan dibandingkan dengan kromatografi kertas yaitu karena dapat dihasilkannya pemisahan yang lebih sempurna, kepekaan yang lebih tinggi, dan dapat dilaksanakan dengan lebih cepat. Di samping hal itu, hasil dari metode KLT juga sudah tercantum dalam Farmakope Herbal Indonesia sehingga dapat dijadikan acuan bagaimana seharusnya hasil yang baik dari ekstrak daun jambu biji yang memiliki kuersetin. Perbedaan nilai Rf berhubungan dengan kesukaan. Senyawa polar akan lebih suka bersama dengan yang polar. Begitu pula sebaliknya, senyawa nonpolar lebih suka bersama dengan yang nonpolar. Silika gel bersifat polar. Eluen yang digunakan pada KLT yang dilakukan juga bersifat polar. Tetapi tingkat kepolaran keduanya berbeda. Silika gel memiliki tingkat kepolaran yang lebih tinggi dibandingkan dengan eluen yang merupakan campuran nbutanol, asam asetat, dan air. Oleh karena itu, semakin polar suatu senyawa maka nilai Rfnya akan semakin kecil. Hal tersebut dikarenakan kepolaran sampel yang mendekati tingkat kepolaran dari fasa diam sehingga sampel lebih suka berada bersama dengan fasa diam dan sulit mengikuti fasa gerak untuk bergerak. Pada pelaksanaannya eluen harus dijenuhkan terlebih dahulu. Tanda dari jenuh adalah sudah terasa naik suhu dari dalam chamber. Apabila telah jenuh, artinya dalam chamber fasa diam telah berada dalam fasa uap sebagian. Maka itu menandakan bahwa fasa diam yang telah ditotolkan larutan baku dan sampel boleh untuk dimasukkan. Jika eluen telah naik ke fasa diam, pemeriksaan dengan KLT dilanjutkan dengan melihat bercak. Melihat bercak dilakukan menggunakan sinar UV. Ada dua panjang gelombang yang digunakan. Pada panjang gelombang 254 nm, sampel yang berfluoresensi. Sementara itu pada panjang gelombang 366 nm, fasa diam yang berfluoresensi. Fluoresensi dilihat sebagai bercak berwarna kuning.

Hasil yang didapat dari KLT ini adalah Rf kuersetin 0,95 dan Rf sampel 0,25. Seharusnya selisih antara Rf sampel dan kuarsetin kecil, karena sesuai dengan farmakope Herbal Indonesia bahwa jambu biji mengandung kuarsetin. Hal ini terjadi dikarenakan penotolan yang tidak tepat dan kurang teliti dan perbandingan eluen yang kurang tepat. Lalu didapat Rf asam galat yaitu 0, berarti ini menunjukkan bahwa jambu biji tidak memiliki kandungan asam galat, dan Rf Rutin yang didapatkan yaitu 0,767 yang berarti jambu biji memiliki kandungan Rutin yang sedikit. Penentuan kadar kuersetin pada ekstrak Psidium guajava dilakukan dengan mertode spektrofotometri sehingga dapat konsentrasi dibaca melalui perubahan warna yang terbaca pada alat spektrofotometer dengan menggunakan cahaya pada gelombang tertentu yang dapat diserap oleh sampel. Penggunaan metode ini melibatkan nilai absorbansi dan panjang gelombang, maka perlu dibuat sebuah kurva baku dengan tujuan untuk dapat mengetahui rentang absorbansi yang dihasilkan pada berbagai konsentrasi dengan menggunakan larutan baku kuersetin untuk mendapatkan suatu persamaan dan panjang gelombang terbaik yang akan digunakan untuk pembacaan hasil kelak. Larutan baku kuersetin dibuat dalam konsentrasi 40,60,80,100 dan 120 ppm (μg/mL atau mg/L) yang diencerkan dari larutan stock yang telah dibuat pada konsentrasi 200 ppm (5000 μg/25 mL) dan masing- masing dibuat

sebanyak

menggunakan

10

ml

dalam

pipet volume untuk

labu

ukur

larutan

dengan pemindahan

memastikan bahwa volume yang

terpindahkan maupun yang dibuat jumlahnya akurat karena akan berpengaruh terhadap pembacaan absorbansi sehingga secara tidak langsung berpengaruh terhadap hasil kurva baku dan persamaan yang akan dibuat. Kemudian ke dalam masing-masing larutan baku...