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LA CLASSIFICATION Objectifs de tout le cours : - Apprendre et savoir réciter par cœur, surtout les parties techniques non moléculaires - Comprendre les techniques - Mémoriser les nomenclatures et les buts et principes des techniques - Mettre en relation avec les TD et les TP PARTIE A : CLASSIFICATION, DEFINITION DE L’ESPECE ET DE LA SOUCHE, NOMENCLATURE 1. LA TAXONOMIE OU CLASSIFICATION OU SYSTEMATIQUE Taxonomie : c’est la science de la classification L’ensemble des principes et théories qui permettent de classer et de valider le classement des organismes. Classification : on classe avec des similarités, aujourd’hui séquence d’ADN - Biologie moléculaire, biochimie - Morphologie, mobilité, type respiratoire - Écologie, physiologie Nomenclature : on donne un nom Identification : on détermine quel est la famille, le genre, l’espèce Unité de la classification : l’espèce 2. EXEMPLE D’UN ECHELON HIERARCHIQUE DES BACTERIES

On peut ajouter des souscatégories que l’on nomme les sous-embranchements, les super-classes, les sous-classes, les sous-espèces.

3. NOMENCLATURE BINOMIALE Chaque espèce est désignée par deux mots : le genre et l’espèce. On note le nom en latin et en italique, on met une majuscule au genre et on laisse en minuscule l’espèce. En latin il n’y a pas d’accent. Universel : Homo sapiens est un grand sage Après une citation, on peut écrire en abrégé (initiale du genre suivit d’un point, puis le nom de l’espèce, exemple C. botulinum). Si on ne peut pas mettre en italique le nom on le souligne.

Le nom vernaculaire est le nom courant d’une espèce : on parle plutôt du bacille de Koch plutôt que de Mycobactérium tuberculosis. Choix du nom = aucune règle Groupement ou Inventeur Référence à une maladie forme Escherich : Escherichia Chaînette : StreptoClostridum botulinum Edwin Klebs : Klebsiella Pinceau : PenicillStreptococcus pyogenes (pyo = pus) Daniel Salmon : Salmonella Rhizobium (contamine les racines 4. DEFINITION DE L’ESPECE ET ORIGINALITE DES BACTERIES Une espèce bactérienne peut être définie comme le rassemblement des souches ayant des relations ADN/ADN qui se traduisent par des valeurs d’hybridation > 70% et un GC% à peu près identique. L'espèce est l'entité fondamentale des classifications, qui réunit les êtres vivants présentant un ensemble de caractéristiques communes : • morphologiques, anatomiques, physiologiques, biochimiques et génétiques Les espèces sont regroupées en genres et divisées en sous-espèces. L’espèce est le groupe d'êtres vivants pouvant se reproduire entre eux (interfécondité) et dont la descendance est fertile. NON applicable aux bactéries. Souches ( = mutant ou variant) : groupe de bactéries issues d’une même cellule mère et présentant une particularité identifiable au sein de l’espèce ; souche E. coli O157 : H7. 5. CLASSIFICATION DES BACTERIES Classification génotypique (années 70) : - Même espèce si plus de 70% d’identité de séquence - Taux de GC% (C+G)/(A+T+C+G)x100 Classification phylogénétique ou phylétique (années 80) : - ARN 16S / ARN 18S Classification phénétique (la plus ancienne) : - Forme, gram, mobilité, pathogénicité - Toujours d’actualité surtout en milieu médical

Les différentes classifications des bactéries : On peut être amené à avoir différentes classifications. Exemple : Cas de la Bactériologie médicale Phylogénétique versus Phénétique - Clinique : classification selon le syndrome (endocardites, méningites, …) - Pathogénicité : pathotypes ou pathovars - Maladies dues aux staphylocoques - Maladies dues aux streptocoques Classification de Lancefield vs taxonomie ADN - Maladies dues aux mycobactéries, … - Bactéries responsables de toxi-infections - Bactéries productrices d’exotoxine Ainsi, en bactériologie, on dit qu’il n’y a pas vraiment de nomenclature et de classification officielles mais : - Validation d’une nouvelle espèce se fait si publication dans International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology - Bergey’s Manuel of Systematic Bacteriology est l’ouvrage de référence (1ère édition 1923) PARTIE B : CRITERES NON MOLECULAIRES SERVANT A LA CLASSIFICATION DES BACTERIES 1. Les toxines On distingue les endotoxines et les exotoxines : - Endotoxine sont accrochées : toxine contenue dans un germe (bactérie) qui reste à l'intérieur du cytoplasme au lieu de diffuser à l'extérieur - Exotoxine sont libres, sécrétées et dehors : toxine bactérienne diffusant dans le milieu ambiant Les toxines diphtériques ont été découvert en 1888 par Roux et Yersin. Les toxines sont des substances toxiques élaborées par une bactérie ayant un pouvoir immunogène.

a. Différences entre endotoxine et exotoxine ENDOTOXINE Toxine contenue à l’intérieur d’une bactérie ou au niveau de sa paroi (retenue par un filtre < 0,2 μm) Libérée uniquement au moment de la lyse Typique des GRAM- (exemple : LPS) Ne provoque pas de maladie spécifique mais des troubles (fièvre, choc septique) Dose toxique : mg/ml Pas d’anatoxine ni d’antitoxine E.coli : Cytotoxine => Diarrhée Shigella dysenteriae : Toxine de Shigelle => Détruit les cellules Vibrio cholerae : Toxine cholérique => Diarrhée

EXOTOXINE Toxine sécrétée par une bactérie au cours de sa multiplication Se déplace dans le corps Typique des GRAM + Protéine soluble (non retenue par un filtre < 0,2 μm)

Thermolabile sauf les entérotoxine staphylococcique Provoque une maladie spécifique (tétanos) Dose toxique : μg/ml Fait partie des toxiques les plus puissants 1 mg d’exotoxine botulinique tue 1 tonne de matière vivante Indice de toxicité arsenic = 0,03 contre 700000 pour la botulique Possibilité d’anatoxine et d’antitoxine

b. Définition d’anatoxine et d’antitoxine Anatoxine : toxine bactérienne traitée, ayant perdu ses propriétés toxiques mais conservé ses propriétés immunisantes. On l’utilise pour la fabrication d’anticorps neutralisant. Antitoxine : anticorps élaboré par l'organisme qui réagit contre les toxines. Durée de vie dans le corps limitée. On passe d’une exotoxine à une anatoxine par chauffage doux ou avec du formol ce qui conduit à une dénaturation protéique. c. Utilité de l’anatoxine et de l’antitoxine Possibilités avec l’antitoxine d’élaborer des dosages (détection AG) ou de faire de la sérothérapie. Sérothérapie : • immunisation passive et transitoire par injection souvent sous-cutanée d’antitoxine d’origine animale ou humaine • permet de neutraliser une toxine, une bactérie, un antigène microbien, un venin, … • passive : le corps apprend à x des AC contre l’antitoxine PAS contre l’anatoxine

• transitoire : l’antitoxine (= Ig) est une protéine ; elle a donc une durée de vie limitée dans le corps ; elle disparaît ; le corps n’a plus alors d’antitoxine ; il est à nouveau vulnérable d. Autres utilité de l’anatoxine-antitoxine versus exotoxine Principe de la vaccination = immunisation active (presque permanente) Le corps apprend à x les antitoxines Le système immunitaire garde la mémoire de la x Il y aura x d’antitoxine dès que l’exotoxine sera présente dans le corps La sérothérapie est une immunisation passive. La vaccination est une immunisation active. 2. Les formes et groupements a. Principale forme des bactéries Pour décrire une bactérie on commence par la forme. Forme ronde = COQUE (coccus) - Coccus ovoïde Forme allongée = BACILLE (bacillus) - Bacille en virgule - Bacille en haltère - Bacille à bout carré - Bacille fusiforme - Bacille en « massue » - Bacille spiralé On trouve également une forme qui est un mélange des deux nommée Coccobacille. b. Principaux groupements Les groupements se font à partir d’un bouillon, d’une culture en milieu liquide. Diplocoque : Diplobacille :

deux deux

coques bacilles

Tétrade : quatre Amas : beaucoup de Diplocoque capsulé : l’entoure Chaînette Chaînette

de de

cocci : bacilli :

coques bactéries diplocoque

avec

une capsule qui

streptocoque streptobacille

Bacille en « palissade » : bacilles les uns a côtés des autres Bacille en groupement en paquet d’épingles : bacilles qui se chevauchent c. Comment observer la forme et les groupements ?

A l’état frais : lame + lamelle avec une goutte d’une suspension de bactéries vivantes On observe cet état avec un MO (x400) qui a un diaphragme fermé et un condenseur baissé. La coloration : lame d’un frottis bactérien On observe la coloration avec un MO (x1000) qui a un diaphragme ouvert et un condenseur monté.

d. Epaisseur de la paroi et coloration de Gram GRAM (1853-1938) est un médecin, bactériologiste et pharmacien danois. Si la couleur est violette on a affaire à une paroi épaisse : GRAM + Si la couleur est rose on a affaire à une paroi fine : GRAM – La coloration du cytoplasme est un reflet de l’épaisseur de la paroi. Les colorants se fixent dans le cytoplasme uniquement. Etape de la coloration de Gram : - On fixe les bactéries grâce à un frotti et on réalise une déshydratation (grâce à de l’alcool 100 que l’on flambe) - On les colore avec du violet de gentiane. Le violet va rentrer dans le cytoplasme et va se fixer sur des structures. - On réalise un mordançage avec du Lugol. La liaison entre le colorant et les structures est permise grâce au Lugol. - On décolore le tout avec de l’alcool 100 . Les bactéries GRAM – vont alors se décolorer mais pas les GRAM + car l’alcool n’a pas pu rentrer dans le cytoplasme. - On réalise une contré coloration à l’aide de la fuschine. Les GRAM + reste violette tandis que les GRAM – deviennent roses. - On sèche la lame puis on met une goutte d’huile à immersion. - On observe le tout avec un objectif de 100 (grossissement x1000).

e. Coloration de Ziehl-Nielsen

Certaines bactéries se colorent mal au Gram, on les appelle des bactéries résistantes à la coloration acide-alcool. On met alors de la fuschine 10 minutes à chaud, puis on décolore à l’acide puis à l’alcool, et on réalise une contre-coloration à froid au bleu de méthylène. Seules les BAAR seront rouges, les autres bactéries seront bleues. BAAR : bacilles acido-alcoolo-résistants

f. Utilité de la coloration de Gram APPRENDRE PAR CŒUR  La coloration de Gram colore le cytoplasme. Elle permet de décrire et de classer les bactéries selon : - La forme - Le groupement - La structure de la paroi (mince ou épaisse) La coloration de Gram ne colore pas : - La paroi - Les flagelles - La capsule - Les spores g. Colorations de structure spécifique Pour colorer un spore on utilise la coloration de Schaeffer-Fulton à chaud avec du vert de malachite et de la safranine. Pour colorer un flagelle on utilise la coloration de Rhodes qui est une imprégnation argentique. Pour colorer une capsule on utilise une suspension de bactéries avec de l’encre de Chine puis on réalise un frottis. Si la coloration n’est pas celle de Gram, ne pas dire que la bactérie est une Gram +/- si elle apparaît rose ou violette. h. Bilan coloration des bactéries C’est -

une étude microscopique qui : Permet de visualiser la forme et le groupement d’’une bactérie Permet de visualiser certaines structures Permet de s’orienter dans la classification

Attention l’étude microscopique ne permet pas de déterminer la mobilité d’une bactérie si la coloration est faite avec un frotti bactérien. Le frotti est un étalement de cellules fixées sur une lame donc les bactéries ne peuvent pas bouger.

Les tests de mobilité se font grâce à l’état frais et grâce aux géloses semisolide en tube.

PARTIE C : AUTRES TECHNIQUES NON MOLECULAIRES SERVANT A LA CLASSIFICATION ET L’IDENTIFICATION DES BACTERIES 1. Les modes de vies a. Les 2 modes majeurs de vie des bactéries Mode PLANCTONIQUE Les bactéries sont isolées les unes des autres Elles sont libres dans le milieu Elles ne sont liées à aucun support C’est le cas typique des bactéries en milieu liquide Mode de vie permettant le déplacement - Passif : mouvement de l’eau - Actif : mobilité (flagelles)

Mode COLONIALE Les bactéries sont accolées les unes des autres Elles vivent en agrégat Elles sont liées à un support C’est le cas de 90% des bactéries en milieu naturel Mode de vie limitant le déplacement Mode de vie où les unicellulaire adoptent un comportement proche de celui d’un tissu pluricellulaire

b. Mode coloniale ou sessile Le mode coloniale ou sessile est le mode de vie fixé sur une surface. Se déroule en 3 étapes : l’attachement, la multiplication et l’agrégation. Sur le gélose on peut trouver des colonies en formes de point ou en forme de ligne (pleins de colonies les une à côté des autre qui donne un aspect de ligne). Les bactéries vivent en communauté soit avec des bactéries 100% identiques soit avec d’autres bactéries ou micro-organismes. Les stromatolithes forment des biofilms. c. Biofilms (1943) Biofilm : communauté de bactérie formant généralement une mince couche visqueuse sur une surface naturelle (dent, rocher) ou artificiel (cathéter, prothèse). Leur mode de protection permet la survie dans un environnement hostile, ce qui facilite la virulence. Les bactéries changent de physiologie en échangeant facilement leurs gènes et en ayant une résistance accrue aux antibiotiques ou encore à la phagocytose.

2. Les observations macroscopiques a. Etude macroscopique des colonies Forme vue de dessus Punctiforme Ronde Ovoïde Irrégulière Fusiforme

Forme vue de profil Petite : < 3 mm Plate Moyenne : 3-6 mm Semi-bombée Grande : > 6 mm Bombée Œuf au plat Bord relevé Taille (en mesure)

Qualification du bord Régulier Ondulé Lobé Dentelé

Les études macroscopique des colonies se font sur des colonies isolées. On note si la colonie est pigmentée mais aussi si à travers la lumière elle est translucide ou opaque. b. Colonies de type S, M ou R Abréviation permettant de résumer un ensemble d’aspect (bord, forme, texture). Colonie de type S : S = smooth = lisse La colonie S est souvent bombée ou semi-bombée. Elle se prélève facilement et est « crémeuse ». Possède une surface lisse et brillante et un bord régulier Exemple : Escherichia coli (entérobactérie) Colonie de type M :

M = mucoid = muqueux Elle a un aspect filant à l’anse de platine. Possède une surface lisse et brillante Exemple : Klebsiella pneumoniae (entérobactérie immobile pouvant capsulée) Colonie de type R : R = rough = rugueux Elle a un aspect sec (aspect en croûte de pain). Possède une surface mate et irrégulière. Le bord est souvent irrégulier. Exemple : pseudomonas stutzeri (bord régulier)

c. Etude macroscopique sur gélose et en bouillon Mettre en relation l’aspect de la colonie (R, S, M) avec l’aspect du bouillon. Le type R fabrique un pigment vert et va dans un milieu liquide répandre son pigment. Les bactéries vont prendre l’aspect de « mie de pain », les bactéries restent agglomérés. L’agglomération des bactéries peut être présente aussi chez un type M. Le type S fabrique un pigment vert. Le bouillon est toujours verdâtre mais il est homogène. Pseudomonas aeruginosa peut exprimer différents aspects macroscopique. 3. Utilisation d’anticorps pour la classification de bactéries Cas typique des streptocoques : Chaînette de coques Gram + Possède une substance C (polyoside C), c’est une molécule antigénique (AG) généralement associé à la paroi. La classification de Lancefield : - Groupable o AG reconnu par un AC, possibilité de savoir si ils portent un polyoside - Non groupable PARTIE D : BACTERIES

TECHNIQUES

CLASSIQUES

DE

LA

MANIPULATION

DES

1. Visibilité des bactéries Les bactéries ne sont pas visibles à l’œil nu sauf si elles sont très nombreuses. Quand le milieu liquide est limpide ( concentration inférieur à 10 6 b/ml) on ne voit rien, quand le milieu est trouble on peut apercevoir les bactéries. On voit des colonies uniquement sur un milieu solide. 2. Règles de l’asepsie L’asepsie n’est pas synonyme de stérile. Quelque chose de limpide n’est pas synonyme de stérile. Asepsie : ensemble de moyen pris pour empêcher la contamination d’objets, de substances, d’organismes ou de locaux préalablement désinfectés. Stérile : pas de forme de vie (cellules mortes ou ADN mais pas de vie).

Le transfert aseptique se fait grâce à un travail autour d’une flamme avec flambage des instruments. 3. Notion d’ensemencement et de contamination La contamination s’oppose à l’ensemencement. L’ensemencement est un apport volontaire de bactéries dans un milieu de culture liquide ou solide. La contamination est un apport involontaire de bactéries dans un milieu de culture.

a. Ensemencement d’un milieu liquide ou bouillon Le but est d’obtenir des bactéries en suspension (attention une suspension pas une solution). Les bactéries forment une suspension. L’ensemencement en milieu liquide ou en bouillon permet : - L’étude microscopique qui permet de déterminer la forme, le groupement, la mobilité et parfois le pigment - Réaliser des tests d’indentification b. Ensemencement d’un milieu solide = isolement sur gélose Le but est d’obtenir des colonies isolées. L’ensemencement d’un milieu solide permet : - L’étude macroscopique qui permet d’identifier la forme, le pigment, la consistance ou l’opacité - Observer si les colonies sont toutes identiques - Obtenir des cultures pures - Disposer des bactéries sous forme de colonies pour faire des tests d’identification c. Obtention d’une culture pure Une culture est pure quand 100% des bactéries sont de la même espèce.

d. Culture pure sur milieu solide

Des colonies avec des macroscopies variées : on est sûr d’avoir différentes espèces bactériennes  colonies impures Des colonies avec des macroscopies homogènes : on a de forte chance d’avoir une seule espèce bactérienne  colonies pures ?

RESUME : Bactérie Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Sarcine (Micrococcus luteus) Streptococcus agalactiae (Groupe B) Streptococcus pneumoniae Entérobactérie (E.coli par exemple) Pseudomonas aeruginosa

EF + Gram C+ immobiles en amas C+ immobiles en amas C+ immobiles en tétrade

Gélose VF Petites colonies de type S AAF opaques pigment or possible Petites colonies de type S AAF opaques pigment blanc porcelaine Petites colonies de type S AAF opaques jaune citron

C+ immobiles en chaînette

Petites colonies de type S translucides sans pigments

AAF

Diplocoque Gram + immobiles capsule possible B- isolé mobile péritriche (sauf K. pneumoniae)

Petites colonies de type S translucides sans pigments

AAF

Moyennes colonies de type S +/- AAF translucides sans pigment (sauf S. marcescens) Coloration jaune/vert...