Laboratorio 2 - BC1 - Grupo 6 Laboratorio (f) PDF

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´Laboratorio 2 Biología de la célula 1...

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INFORME DE LABORATORIO 2 – ANÁLISIS DE MACROMOLÉCULAS

JUDY ELIZABETH PÉREZ PIEDRAHITA CAROLINA CANO GONZÁLEZ MANUELA PÉREZ MONTOYA SANTIAGO PINO SÁNCHEZ EUDIS ORTIZ MORENO

FACULTAD DE MEDICINA UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA GRUPO 3 MEDELLÍN 2018-1

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TABLA DE CONTENIDO

1. INTRODUCCIÓN..........................................................................................................3 2. MARCO CONCEPTUAL...............................................................................................4 3. METODOLOGÍA..............................................................................................................6 3.1 Materiales y Equipos (Para ambos ensayos)............................................................6 3.2 PROCEDIMIENTO.....................................................................................................9 3.2.1 ELECTROFORESIS............................................................................................9 4. DESCRIPCIÓN DE RESULTADOS............................................................................10 4.1

ELECTROFORESIS............................................................................................10

4.2

CROMATOGRAFÍA..............................................................................................11

5. ANÁLISIS DE RESULTADOS.....................................................................................11 5.1

Electroforesis........................................................................................................11

5.2 Cromatografía..........................................................................................................14 6. CONCLUSIONES.......................................................................................................18 7. ANEXO (BIBLIOGRAFÍA)...........................................................................................19

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1. INTRODUCCIÓN

En el siguiente informe del laboratorio se describe la práctica de “Análisis de Macromoléculas”, la cual se realizó por medio de dos procedimientos los cuales son: Electroforesis y Cromatografía en papel. El objetivo con dichos procedimientos en el caso de la electroforesis es observar la separación de las proteínas y como poseer alteraciones en el suero sanguíneo afecta al recorrido que se hace en el gel de agarosa según su movilidad en el campo electromagnético (que sería la cámara de electroforesis); por consiguiente, en la cromatografía se contempló como los factores químicos y físicos logran afectar la ascensión de un pigmento vegetal u orgánico en un papel filtro dependiendo de la solución con la cual se pongan en contacto (agua destilada o MAE) y otros factores como la afinidad del soluto por alguna de las dos fases . Por lo cual en este trabajo se realiza la descripción, interpretación y análisis de ambos procedimientos, para llevar a cabo unas conclusiones certeras y a un entendimiento del fundamento teórico que enmarca cada uno de los ensayos.

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2. MARCO CONCEPTUAL



La electroforesis en gel de agarosa se utiliza comúnmente para separar moléculas en función de su carga, tamaño y forma. Se trata de un medio de separación especialmente eficaz para las biomoléculas cargadas como el ADN, el ARN y las proteínas [1]. En el suero del paciente (que se obtienen a partir de una muestra de sangre) se encuentran varias proteínas con mayor o menor proporción. Si este suero se mezcla con un buffer de carga (como el azul de bromofenol, que aumenta la densidad de la muestra permitiendo que se quede en el pocillo), se controla el pH con la solución tampón TBE (Tris Borato EDTA), y se mantiene constante el voltaje de la cámara de electroforesis, la única variable en teoría que afectaría la velocidad en que se mueven las macromoléculas sería su peso molecular, siendo más rápidas las menos pesadas, y más lentas las que tienen mayor valor en esta variable (así como se nota en la ilustración 0.1).

Ilustración 0.1 – Separación de moléculas por peso. [18] En el suero del paciente nos podemos encontrar dos tipos de proteínas (o bandas del patrón electroforético), las cuales son: ALBUMINA y GLOBULINAS (que pueden ser de tipo α1, α2, ᵦ, ᵧ). Estas proteínas tienen los siguientes rangos de densidad en suero en un paciente adulto sano (o de control), y las siguientes funciones básicas [*]: 

Albumina: 3900 a 5500 mg/dL [2], tiene funciones transportadoras de moléculas y de control de la presión osmótica.



α1: antitripsina, 100 a 200 mg/dL [3], sirven para el control enzimático; es un reactivo de fase aguda y actúa en caso de inflamación tisular. α2: 600 a 1000 mg/dL [3], tiene funciones de transporte y fijación de hemoglobina, neutralización de enzimas, y formación de eritrocitos. ᵦ: 700 a 1200 mg/dL [3], tienen funciones de transporte de minerales y de fijación de elementos del grupo hemo. ᵧ: 700 a 1600 mg/dL [3], también llamadas inmunoglobulinas, que realizan funciones de reconocimiento.

  

4

[*] En este párrafo se responden las preguntas 1 y 3 pedidas en la guía de laboratorio para el ensayo de electroforesis.

Al tener distintas concentraciones de cada una de las macromoléculas, entonces el colorante que se utilice unirá a estas moléculas produciendo un color. Los puntos que sean más oscuros son los de mayor concentración y los de menor concentración tendrán un color más claro. Cuando tenemos un punto con un color oscuro, esto nos indica que hay una concentración elevada de una proteína (como en el caso de la albumina en pacientes de control), mientras que en el caso de que la franja sea clara y de un ancho mayor, significa que la concentración es más baja y que son moléculas diferentes, pero de similar peso molecular (como en el caso de gamma). 

La cromatografía es una técnica de separación basada en el principio de retención selectiva, que permite separar los distintos componentes de una mezcla facilitando su identificación (como se puede observar en la ilustración 0.2).

Ilustración 0.2 – Separación de moléculas por capilaridad. [19] Las técnicas cromatográficas son muy variadas, sin embargo, en todas, el fenómeno de separación ocurre al hacer pasar una fase móvil fluida (gas, líquido o fluido supercrítico), que arrastra a la mezcla, a través de una fase estacionaria constituida por un sólido finamente dividido o un líquido fijado en un sólido [4]. En este laboratorio se utilizó como fase estacionaria el papel filtro y como fase móvil es agua destilada y el MAE (solución que contiene metanol, etanol, y ácido acético). Se utilizaron pigmentos de origen orgánico y de origen natural, cada uno presenta una composición molecular diferente, es decir sus moléculas son de diferentes tamaños, formas y afinidad. Cuando el papel está en contacto con el eluyente este último asciende por el primero, luego cuando sube hasta el punto en donde está fijado el pigmento, comenzará a arrastrarlo a diferentes velocidades en cada pigmento. Esta velocidad depende de dos tipos de afinidades (definiendo este término como la atracción que tienen las moléculas entre sí), la primera es la afinidad entre el soluto (pigmento) y el eluyente, es decir, a mayor afinidad mayor recorrido; la segunda afinidad es entre el soluto y el papel, a mayor afinidad menor arrastre. Después de realizar el ensayo de cromatografía, se obtiene los papeles con los diferentes pigmentos y sus bandas después de que el eluyente asciende.

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3. METODOLOGÍA 3.1 Materiales y Equipos (Para ambos ensayos) 

En la tabla 1 se presentan los materiales utilizados en la práctica de electroforesis y una breve descripción de cada uno: Imagen

Utensilios y Materiales Puntas para micro pipetas

Descripción Las propiedades y la calidad del material del que están hechas influyen en los resultados del pipeteo.

Cámara de electroforesis

Es un dispositivo que permite la generación de un campo eléctrico alrededor de un gel en el que se depositan las muestras.

Placa de gel de agarosa

Para la separación de ADN a través de electroforesis

Fuente de poder

Fuentes de alimentación para electroforesis controladas por microprocesador y que permiten trabajar a voltaje o corriente de salida constantes según las necesidades de cada aplicación. Empleado para succionar y transferir pequeños volúmenes de líquidos y permitir su manejo en las distintas técnicas analíticas.

Ilustración 1[5]

Ilustración 2 [6]

Ilustración 3 [7]

Ilustración 4 [8] Micropipetas de 10 y 20 microlitros

Ilustración 5 [9]

Tabla 1- Materiales y utensilios ensayo de electroforesis.

6



A continuación, se presenta en la tabla 2 y tabla 3 los reactivos utilizados para el ensayo de electroforesis: Disolución de Coloreado de geles. Metanol Ácido Acético Rojo Ponceau

Concentración (%) 40 5 0,1

Tabla 2-

Componentes del colorante.

Disolución decolorante Metanol Ácido Acético

Concentración (%) 40 10

Tabla 3- Componentes del decolorante.

Además, también se utilizó:





Buffer de carga (azul de bromofenol).



Agarosa.



Solución Tampón Tris Borato EDTA.

En la tabla 4 se consignan los pigmentos utilizados para realizar el ensayo de cromatografía (tanto los naturales como los sintéticos:

PIGMENTOS PIGMENTOS NATURALES SINTETICOS Flor de Jamaica Fast Green Cebolla Naranja de Metilo Tabla 4- Pigmentos ensayo de cromatografía.

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Los elementos utilizados para el ensayo de cromatografía se describen brevemente en la tabla 5: Imagen

Utensilios y materiales Papel cromatográfico

Descripción Tira de papel utilizado en la práctica como fase estacionaria del proceso de cromatografía.

Ilustración 6 [10] Capilares

Ilustración 7 [11] Regla

Pequeñas varillas de vidrio huecas con los cuales se puede extraer pequeñas cantidades de líquido por medio del mecanismo de tensión superficial. Artefacto plano que se utilizó para medir el corrido del papel cromatográfico.

Il ustración 8

[12]

Servilleta

Papel absorbente utilizado para apoyar los capilares y las tiras de papel.

Alfileres

Objeto puntiagudo para mantener fijas las tiras de papel.

Ilustración 9 [13]

Ilustración 10 [14] Tabla 5- Materiales y utensilios ensayo de cromatografía.

Para la práctica también se utilizaron dos solventes que funcionarían como fases móviles y que se encuentran en la tabla 6: MAE

AGUA 8

Metanol 20% 100 mL Ácido acético 5% Etanol 40% Tabla 6- Solventes ensayo de cromatografía. 3.2 PROCEDIMIENTO 3.2.1 ELECTROFORESIS Antes de comenzar la práctica, el personal de apoyo llevó a cabo una serie de procesos en los que se encontró preparada la suspensión de agarosa al 1,5% en tampón TBE (procesos de calentamiento y secado), para obtener el gel del ensayo con la cantidad de perforaciones en las cuales se adicionó las muestras. El mapa (o gráfico) que indica cómo se distribuyeron las diferentes muestras en las perforaciones fue: L

V

k

C

P

V

ad o de carga negtiva

V

C

P

V

C

P

V

V

C

P

V

Ilustración 11 – Mapa de pozos identificados para control y paciente. Nota : Dondecada letra corresponde a : V :Vacío

k :C arga

C :C ontrol

P: Paciente

Se calibró la micropipeta a 2μL y se puso la punta, se sustrajo del buffer de carga (azul de bromofenol) la misma cantidad calibrada y se depositó en el papel con forma de pozo; esto se hizo 9 veces, como se mostró en la gráfica anterior. Después se cambió la punta para sustraer 5μL de control, el cual se echó en el pozo de papel número 3, 7, 10 y14; juntando el buffer de carga para que se mezclaran bien sin dejar burbujas. Con la muestra del paciente se hizo lo mismo, pero depositando en los pozos número 4, 8, 11 y 15. Se sustrajo de la mezcla los 7μL de cada pozo del papel para ponerlo en el pozo de la cámara de electroforesis. Se dispensaron en el gel hecho agarosa y el TBE, en el mismo orden cuidando que no se contaminaran los pozos cercanos. Acto seguido se tapó la cámara de electroforesis, se conectó a la fuente de poder y se realizó el corrido (a un diferencial de potencial eléctrico) de 120V. Se esperó 2 horas hasta que las bandas de interés migraran aproximadamente un 60% del gel. Pasadas las 2 horas, se desconectó la cámara. 9

Se sumergió el gel en una solución de tinción que fue el rojo de ponceau, se dejó en el por 15 min agitándose suavemente, una vez transcurrido este tiempo se retiró la tinción y se realizó un lavado con agua para eliminar el exceso de tinción, se dejó al personal de apoyo, el cual le adicionó un decolorante que le fueron cambiando cada 12h hasta completar 24h. Al pasarse 24h de la práctica de laboratorio, se tomó una foto de los resultados. (ya que cada 12 horas aproximadamente se debía volver a sumergir el gel en colorante).

3.2.2 CROMATOGRAFÍA Mientras se esperó la electroforesis, se tomaron 10 tirillas de papel cromatográfico, se marcaron para identificar cuáles serían para de MAE (Metanol, ácido acético, etanol) y agua destilada. Después se midió un centímetro y medio desde el extremo del papel y se hizo una marca; en el centro de las marcas se aplicaron cada uno de los pigmentos y colorantes (Flor de Jamaica, cebolla, fast green, naranja de metilo y fast green más naranja de metilo), asegurando uno por cada colorante en los marcados de MAE y agua destilada. Luego se procedió a extender en el tendedero las tirillas de papel cromatográfico, se aseguró que estuvieran a la misma altura, se adicionaron 20 mL de cada eluyente (agua destilada y MAE). Pasados 30 min, se retiraron los papeles y antes de que se secaran, se marcó la distancia recorrida por el eluyente. Se consignaron los datos en la tabla de resultados. 4. DESCRIPCIÓN DE RESULTADOS 4.1 ELECTROFORESIS Luego de correr el ensayo de electroforesis, y de esperar 24 horas, se obtienen una imagen del patrón electroforético de las muestras de suero (patrón y del paciente en análisis). Esta se muestra en la ilustración 12:

10

Ilustración 12 – Patrón electroforético para un paciente en dos geles distintos. 4.2 CROMATOGRAFÍA Se obtienen la tabla 7 del ensayo de cromatografía: MUESTRA Flor de Jamaica

Cebolla

Fast Green

Naranja de Metilo

Fast Green + Naranja de Metilo

ELUYENTE

DISTANCIA ELUYENTE (cm)

MAE

5.3

Agua Destilada

8.7

MAE

4.8

Agua Destilada

7.8

MAE

5.2

Agua Destilada

8

MAE

5.1

Agua Destilada

7.3

MAE

5.2

Agua Destilada

7.3

COMPONENTES OBSERVADOS Fucsia Café Café

DISTANCIA COMPONENTE (cm) 2.4 3.7 7.4

Verde

≈0

Beige

6.4

Verde Azulado

3.8

Verde Azulado

6.6

Naranja

2.9

Naranja Claro

4.9

Naranja Verde Azulado Naranja Claro Verde Azulado

3.1 3.9 4.9 6.1

Tabla 7- Datos ensayo del ensayo de cromatografía.

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En esta tabla podremos encontrar cada pigmentos o colorantes, y la distancia que recorrió este en los dos diferentes eluyentes, además de los cambios de color u observaciones que se pudieron identificar en el ensayo de cada uno.

5. ANÁLISIS DE RESULTADOS 5.1 Electroforesis En la ilustración 12, se pueden observar dos geles los cuales contienen sueros del mismo paciente. El de la izquierda corresponde al grupo 8 y el de la derecha corresponde al de nuestro grupo. Por motivos de problemas con el colorante, el gel preparado por el grupo no tuvo la suficiente intensidad para obtener las medidas correctas, por lo tanto, para fines de poder realizar este informe se va a tomar como gel de referencia el primero de ellos. Para el gel se pueden identificar los patrones de proteínas (α1, α2, ᵦ, ᵧ) así:

Ilustración 13 – Patrón electroforético para un paciente con patrones. Comparando los valores de los distintos tipos de proteínas respecto a las muestras patrón, se puede decir que: 

La albúmina se encuentra disminuida (como se observa en la ilustración 13) lo cual genera una gran variedad de situaciones clínicas como resultado de la baja de su síntesis o aumento de su catabolismo, ya sea por utilización o por perdida, o la combinación de ambos mecanismos. Una causa importante de la hipoalbuminemia son las enfermedades hepáticas, debido a que la mayoría de a albúmina se produce en el hígado y en consecuencia cualquier daño sobre el parénquima de este disminuye las síntesis de la proteína. Una causa relativamente frecuente de la hipoalbuminemia es la perdida de proteínas a través de los glomérulos renales dañados. 12



α1 globulinas se encuentra disminuida (como se puede notar ilustración 13). La deficiencia de la α1-antitripsina, que es sintetizada en el hígado, se debe a un problema en este. En los pacientes con cirrosis se puede encontrar disminución de esta banda, proporcional al grado del daño hepático. También se puede encontrar disminuidas en los pacientes que tienen deficiencia de lipoproteínas de alta densidad, como la enfermedad de Tangier.



α2 globulinas también se encuentra disminuida en el ensayo. La disminución se presenta en las enfermedades hepáticas severas, en los pacientes que reciben estrógenos por largos periodos, en las anemias megaloblásticas o hemolíticas independiente de la causa y en los procesos de resolución de grandes hematomas. También puede tener descenso por los niveles séricos de ceruloplasmina en la enfermedad de Wilson, en la desnutrición, síndrome nefrótico y en los pacientes con enfermedades perdedoras de proteínas.



β globulinas se encuentra disminuida, lo cual no es frecuente en la clínica y cuando esto se presenta, usualmente se asocia con un problema de nutrición (por proteínas).



γ globulinas Está compuesta predominantemente por anticuerpos del tipo inmonuglobilinas G (IgG), A (IgA), D (IgD) y E(IgE). Se observan marcadamente elevadas (en la ilustración 13). Estos niveles superiores a los valores normales pueden indicar endocarditis bacteriana sub-aguda, tiroiditis autoinmune, linfogranuloma venéreo y varias enfermedades del colágeno. También en numerosas enfermedades sub-agudas crónicas inflamatorias y proliferativas, incluyendo neumonías, tuberculosis, cistitis, pielitis, colecistitis, enfermedades hepáticas, malignas y enfermedades renales. En general, se puede decir que el paciente cuenta con un patrón electroforético que tiene varias similitudes con la enfermedad de CIRROSIS HEPÁTICA (como se observa en la ilustración 14), cabe aclarar que este diagnóstico no estaría totalmente confirmado sin realizar otros ensayos que lo respalden (como elastografía por resonancia magnética o elastografía de transición, pruebas por imágenes diagnósticas, o biopsia). [*]

13

Ilustración 14 – Patrón electroforético para un paciente con cirrosis hepática.

[15]

[*] En esta página se responde la pregunta 2 pedida ...