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Lección 6. La pared celular bacteriana Tinción de Gram La pared celular es responsable de lo que le sucede al colorante utilizado en la Tinción de Gram. La propiedad de teñirse o no de violeta oscuro (Gram positivas o Gram negativas) por esta coloración es un criterio de clasificación importante correlacionable con otras propiedades bacterianas. Unos pocos organismos son Gram-variables. ➔ Tanto las Gram-positivas como las Gram-negativas captan la misma cantidad de cristal violeta (CV) e iodo (I). ➔ El complejo CV-I sin embargo es atrapado dentro de la célula Gram positiva por la deshidratación y la reducción del tamaño de los poros de la pared resultante del proceso de lavado con solvente. ➔ En las Gram negativas la fina (y probablemente discontinua) capa de peptidoglicano no impide la extracción por el solvente del complejo. Si después de su tinción se tratan con lisozima bacterias Gram positivas, se ve que los protoplastos siguen teñidos, pero pierden el colorante si se los trata con alcohol. Esto indica que el colorante es fijado a nivel del protoplasto, y que la pared celular de las bacterias Gram positivas es la que impide la extracción del colorante.

Relación de la estructura de la pared celular con la tinción de Gram La diferencia estructural entre la pared celular de las bacterias grampositivas y la de las gramnegativas es la causa de las diferencias en la reacción con el colorantes de Gram. Recordemos que en la tinción de Gram se forma un complejo insoluble entre el cristal violeta y el yodo en el interior de la célula. En las bacterias gramnegativas, este complejo se extrae con alcohol, pero no en las grampositivas. Las bacterias grampositivas tienen una pared muy gruesa formada fundamentalmente por peptidoglicano. Durante la tinción de Gram, la pared celular grampositiva es deshidratada por el alcohol, que hace que los poros de las paredes se cierren e impide así que se escape el complejo insoluble de cristal violeta e yodo. En las bacterias gramnegativas, por el contrario, el alcohol penetra rápidamente a través de la membrana externa rica en lípidos y extrae el complejo cristal violeta-yodo de la célula. Después del tratamiento con el alcohol, las células gramnegativas son prácticamente invisibles a menos que se vuelvan a teñir con un segundo colorante, un procedimiento estándar en la tinción de Gram.

Estructura general de la pared celular Las bacterias grampositivas se tiñen de color azul violeta y las gramnegativas adquieren un color rosa o rojo. La diferencia estructural verdadera entre ambos grupos se puso de manifiesto con el desarrollo del microscopio electrónico: ● La pared de una célula Gram positiva está formada por una única capa homogénea de 20 a 80 nm de grosor de peptidoglicano o mureína, situada por fuera de la membrana celular. ● La pared de la célula Gram negativa es más compleja; posee una capa de 2 a 7 nm de grosor de peptidoglicano rodeada por una membrana externa. En las microfotografías electrónicas se observa un espacio entre la membrana plasmática y la externa de las bacterias Gram negativas y, a menudo entre la membrana plasmática y la pared celular en las Gram positivas. Dicho espacio se denomina espacio periplásmico y está ocupado por un gel, el periplasma. El espacio periplásmico de las bacterias Gram negativas contiene: ● Muchas proteínas que participan en la captación de nutrientes, por ejemplo enzimas hidrolíticas que convierten las macromoléculas en productos más pequeños que pueden ser metabolizados por la bacteria. ● El espacio periplásmico contiene también enzimas que participan en la síntesis del peptidoglicano y en la modificación de compuestos tóxicos que podrían lesionar la célula.

Composición química y estructura del peptidoglicano El peptidoglicano o mureína es un gran polímero compuesto por muchas subunidades idénticas. El polímero contiene dos aminoazúcares: ● ●

N-acetilglucosamina Ácido N-acetilmurámico

Ambos están unidos entre sí en la posición β1-4- glucosídico. El esqueleto de este polímero está formado por residuos alternantes de N-acetilglucosamina (NAG) y ácido N-acetilmurámico (NAM). Una cadena peptídica de cuatro aminoácidos (D-glutámico, L-alanina, D-alanina y L-lisina) alternantes está conectada a un grupo carboxilo del ácido N-acetilmurámico. Los tetrapéptidos de una y otra cadena de peptidoglicano se unen entre sí por puentes peptídicos. Existen diferencias en el espesor de esta capa de peptidoglicano: ➔ Las bacterias Gram positivas tienen una capa gruesa de 0,02 a 0,06µm en forma de capas múltiples ➔ Las bacterias Gram negativas y las ácido alcohol resistentes tienen una capa fina de peptidoglucano de 0,01 µm aproximadamente.

Proceso de transpeptidación

El entrecruzamiento se produce en distintos grados en especies diferentes de Bacteria, y cuanto más extenso es, mayor es la rigidez que aporta. En las bacterias gramnegativas, el entrecruzamiento del peptidoglicano está formado por un enlace peptídico entre el grupo amino de DAP de una cadena de glicano y el grupo carboxilo de la D-alanina terminal de la cadena de glicano adyacente. En las bacterias grampositivas, el entrecruzamiento se produce normalmente a través de un pequeño puente peptídico, en el que la clase y el número de aminoácidos varían de una especie a otra.

Obtención de protoplastos bacterianos Algunos agentes pueden destruir el peptidoglicano. Uno de ellos es la lisozima, una enzima que corta el enlace glucosídico B-1,4, entre la N-acetilglucosamina y el ácido N-acetilmurámico en el peptidoglicano, con el consiguiente debilitamiento de la pared celular. Cuando esto ocurre, el agua puede entrar en la célula y provocar la lisis celular. La lisozima está presente en algunas secreciones animales, como las lágrimas, la saliva y otros líquidos corporales, y funciona como línea de defensa principal frente a las infecciones bacterianas. El antibiótico penicilina también ataca al peptidoglicano, pero de manera diferente a las lisozimas. Mientras que las lisozimas destruyen el peptidoglicano existente, la penicilina impide su biosíntesis, de manera que debilita la pared y favorece la lisis osmótica. OBS: si no queda nada de peptidoglicano se denomina protoplastos. Si queda restos se le denomina esferoplastos.

Paredes celulares Gram positivas Muchas bacterias grampositivas tienen moléculas ácidas, llamadas ácidos teicoicos, embebidas en la pared celular. El término ácidos teicoicos comprende todos los polímeros formados por glicerol-fosfato o ribitol-fosfato de la pared celular, la membrana citoplasmática y la cápsula. Como los fosfatos están cargados negativamente, los ácidos teicoicos son en parte responsables de la carga eléctrica total negativa de la superficie celular. Algunos ácidos teicoicos están unidos covalentemente a lípidos de membrana, y en ese caso reciben el nombre de ácidos lipoteicoicos. Tanto los ácidos teicoicos como los lipoteicoicos, tienen la función de estabilizar la pared celular.

Paredes celulares Gram negativas Podemos observar tres zonas: ● ● ●

La membrana plasmática; El espacio periplásmico que incluye una fina capa de peptidoglicano; La membrana externa;

Esta última, exclusiva de las bacterias gramnegativas, es una bicapa lipídica que difiere de otras membranas por su capa externa, que está constituida por: ● ● ●

una molécula anfipática: el lipopolisacárido (LPS); fosfolípidos; proteínas que la unen al peptidoglicano;

El LPS está constituido por tres partes: ● El lípido A; ● El polisacárido central o del core;

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La cadena lateral O;

El lípido A no es un lípido típico, derivado del glicerol, sino que los ácidos grasos están unidos mediante los grupos amino de un disacárido compuesto por dos unidades de fosfato de glucosamina. El LPS sustituye a muchos de los fosfolípidos en la mitad exterior de la membrana externa, y sirve de anclaje para unir la membrana externa al peptidoglicano. Así, aunque técnicamente la membrana externa sea una bicapa lipídica, su estructura es diferente al de la membrana citoplasmática. Aunque su función principal es aportar resistencia a la célula gramnegativa, una importante propiedad biológica del LPS es su toxicidad para los animales. Entre las bacterias gramnegativas patógenas para los humanos más conocidas se encuentran especies de Salmonella, Shigella y Escherichia, y algunos de los síntomas gastrointestinales que provocan estos patógenos se deben a la toxicidad de los componentes de la membrana externa ; toxicidad que está asociada a la capa LPS, y en particular al lípido A. El término endotoxina se refiere a este componente tóxico del LPS. Algunas endotoxinas causan violentos síntomas en humanos, como flatulencias, diarrea y vómitos.

Membrana externa Aunque es permeable a las moléculas pequeñas, la membrana externa es impermeable a las proteínas y las moléculas más grandes. En realidad, una de sus funciones principales es impedir que las proteínas que llevan a cabo su actividad fuera de la membrana citoplasmática escapen de la célula por difusión. Estas proteínas se encuentran en una zona denominada periplasma. Está ubicado entre la superficie exterior de la membrana citoplasmática y la cara interior de la membrana externa. El periplasma tiene una consistencia gelatinosa a causa de la gran concentración de proteínas que contiene.

Dependiendo del organismo, el periplasma puede contener varias clases diferentes de proteínas. Pueden ser: ● ● ●

Enzimas hidrolíticos: se ocupan de la degradación inicial de las moléculas de los alimentos; Proteínas de unión: empiezan el proceso de transporte de sustancias; Quimiorreceptores: proteínas que dirigen la respuesta quimiotáctica;

La mayoría de estas proteínas llegan al periplasma por la acción de un sistema de exportación de proteínas presente en la membrana citoplasmática. La membrana exterior es relativamente permeable a las moléculas pequeñas (incluso a moléculas hidrófilas) por la presencia de unas proteínas llamadas porinas, que funcionan como canales para la entrada y salida de solutos. Se conocen varias porinas, tanto específicas como inespecíficas. ● ●

Porinas inespecíficas: forman canales llenos de agua, a través de los cuales pueden pasar cualquier sustancia pequeña. Porinas específicas: tienen un sitio de unión para una sola sustancia o para un grupo reducido de sustancias estructurales relacionadas.

Las porinas son proteínas transmembranales formadas por tres subunidades idénticas. Además del canal presente en cada barril de la porina, los barriles de las tres proteínas de una porina se asocian de manera que se forma un pequeño hueco de 1nm de diámetro en la membrana externa a través del cual pueden pasar moléculas muy pequeñas.

Crecimiento de la pared celular y división celular En un cultivo en crecimiento de un bacilo bacteriano como Escherichia Coli, l as células se alargan hasta aproximadamente el doble de su longitud original y después forman un tabique que divide la célula en dos célula hijas. Este proceso recibe el nombre de fisión binaria. Formación del divisoma Hay una serie de proteínas presentes en todas las bacterias que son esenciales para la división celular. Se llaman proteínas Fts, y una de ellas, la proteína FtsZ, tiene un papel crucial en el proceso de fisión binaria. FtsZ está emparentada con la tubulina, proteína importante en la división celular eucariota. La bacteria gramnegativa Escherichia coli y la  an sido las especies modelo bacterianas para el estudio de grampositiva Bacillus subtilis h los procesos de división celular. Las proteínas Fts interaccionan en la célula para formar un aparato de división llamado divisoma. En los bacilos, la formación de un divisoma empieza con la unión de moléculas

FtsZ para formar un anillo que rodea exactamente la parte central de la célula; este anillo se convertirá en el plano de división celular. El divisoma también contiene las proteínas Fts necesarias para la síntesis de peptidoglicano, como FtsI, que es una de las varias proteínas de unión a la penicilina presentes en la célula. Estas proteínas reciben este nombre porque la penicilina inhibe su actividad. El divisoma dirige la síntesis del nuevo material de la membrana y la pared celular, para ir formando un septo de división en el centro del bacilo, hasta que este alcanza el doble de su longitud original. Entonces, la célula alargada se divide y da lugar a dos células hijas. Biosíntesis del peptidoglicano En las células de todas las especies de Bacteria que contienen peptidoglicano, que son la mayoría, el peptidoglicano preexistente se tiene que cortar temporalmente para permitir que el recién sintetizado se inserte durante el proceso de crecimiento. En los cocos, el nuevo material de pared crece en sentido opuesto desde el anillo FtsZ, mientras que, como hemos visto,en los bacilos crece en diversos sitios a lo largo de la célula.

Síntesis de la pared celular en las bacterias grampositivas. Se puede pensar en el peptidoglicano como una tela resistente a la tensión, muy parecida a una lámina fina de goma. La síntesis del nuevo peptidoglicano durante el crecimiento requiere el corte controlado del peptidoglicano preexistente y la inserción simultánea de los precursores del peptidoglicano. Una molécula transportadora de lípidos llamada bactoprenol ejerce una función fundamental en este último proceso: ●

El bactoprenol es un alcohol C55 hidrófobo que se una a un N-acetilglucosamina/ácido N-acetilmurámico/petapéptido, precursor del peptidoglicano.

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El bactoprenol transporta los precursores del peptidoglicano a través de la membrana citoplasmática haciéndolos lo bastante hidrófobos para atravesar-la. Una vez en el periplasma, el bactoprenol interacciona con transglicosilasas, unas enzimas que insertan los precursores en el punto de crecimiento de la pared celular y catalizan la formación del enlace glicosídico. Antes de esto, otras enzimas llamadas autolisinas, que actúan hidrolizando los enlaces que conectan la N-acetilglucosamina y el ácido N-acetilmurámico al esqueleto, hacen unos pequeños cortes en el peptidoglicano existente. Entonces se añade nuevo material de pared a través de esos cortes. La unión entre el peptidoglicano viejo y el nuevo forma un cordoncillo en la superficie celular de las bacterias grampositivas que se llama banda de pared. Es imprescindible que a síntesis del peptidoglicano sea un proceso coordinado de manera precisa. Las nuevas unidades de tetrapéptidos deben empalmarse al peptidoglicano existente inmediatamente después de que las autolisinas actúen, para impedir la formación de una brecha en la integridad del peptidoglicano en el punto de empalme, pues una brecha podría causar la lisis espontánea de la célula, llamada autolisis.

El paso final de la síntesis de la pared celular es la transpeptidación. ● ●

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En la transpeptidación se forman los puentes peptídicos entre los residuos de ácido murámico en cadenas adyacentes de glicano. En las bacterias gramnegativas como Escherichia coli , los puentes se forman entre el ácido diaminopimélico (DAP) de un péptido y la D-alanina al final del precursor del peptidoglicano, solo uno permanece en la molécula final; el otro es eliminado durante la transpeptidación. Esta reacción es exergónica y suministra la energía necesaria para que se produzca la transpeptidación.

Bacteria ácido-alcohol resistente ¿Qué es una bacteria ácido-alcohol resistente? Bacterias, cuya pared celular poseen ácidos micólicos de cadenas carbonadas especialmente alargadas, se les conoce como bacterias ácido-alcohol resistentes debido a que los ácidos grasos presentes en la pared celular retienen el colorante cuando son decolorados con alcohol y ácido. Las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias contienen ácidos grasos (ácidos micólicos) de cadena larga que les confiere la propiedad de resistir la decoloración con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos. Por esto se denominan ácido-alcohol resistentes. La coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Al suspender el calentamiento y enfriar

con agua, provoca una nueva solidificación de los ácidos grasos de modo que el colorante ya no puede salir de las bacterias. Géneros de bacterias ácido-alcohol resistentes: ● Mycobacterium: l a alta concentración de ácido micólico en la pared celular es la causante de la baja absorción y alta retención de la tinción (fucsina).  fecta a los pulmones, la piel o el cerebro y se presenta principalmente en ● Nocardia: a personas con sistemas inmunitarios debilitados.

Paredes celulares en Archaea El peptidoglicano está ausente en la pared celular de las Archaea , y normalmente tampoco encontramos en ellas membrana externa. En cambio, cuentan con una amplia variedad de tipos de pared celular, que pueden contener polisacáridos, proteínas y glicoproteínas. -

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La pared celular de ciertas Archaea metanogénicas contiene una molécula con una parecido notable al peptidoglicano, un polisacárido llamado pseudomureina. El esqueleto de la pseudomureina está formado por unidades repetitivas alternantes de N-acetilglucosamina (también presente en el peptidoglicano) y ácido N-acetilalosaminurónico; este último sustituye al ácido N-Acetilmurámico del peptidoglicano. Los enlaces glicosídicos de la pseudomureina se da en ß-1,3, y los aminoácidos son todos estereoisómeros L.

Las paredes celulares de otras Archaea carecen de pseudomureina y en su lugar tienen otros polisacáridos. Así como: ● Methanosarcina; ● Halococcus; ● Methanosarcina;...