Métodos de estudio de ácidos nucleicos. Preparación de DNA y RNA. Cuantificación. PDF

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Tema 6. Métodos de estudio de ácidos nucleicos. Preparación de DNA y RNA. Cuantificación. Métodos de biología molecular Son técnicas altamente sensibles y específicas. Tiene aplicaciones en el campo de la microbiología, diagnóstico y pronóstico del cáncer, diagnóstico de enfermedades metabólicas congénitas, identificación forense y paternidad y farmacogenómica, entre otras. En una fase pre-analítica las muestras para análisis de DNA, al ser una molécula bastante estable, requiere transporte y conservación a 4ºC, no hace falta congelar la muestra. Algunos análisis requieren cantidades ínfimas de muestra (PCRs) y otros requieren concentraciones de DNA altas y en gran pureza y mínima fragmentación (Southern blot, por ejemplo). Las muestras para análisis de RNA, al ser una molécula inestable y de rápida degradación, se tiene que estabilizar de inmediato con RNA later o congelándola en nitrógeno líquido o directamente utilizar el tejido fresco o la sangre recién extraída. Debido a su estructura química el RNA es una molécula muy frágil que puede romperse por acción de los grupos 2’-OH (altamente reactivos) adyacentes al esqueleto de ribosa-fosfato. Dado que las RNAsas no van a ser inactivadas en su totalidad en el autoclave, resulta esencial trabajar con material estéril y de preferencia de un solo uso. El material de vidrio debe lavarse con una solución 0.5N de NaOH, enjuagarse tres veces con agua deionizada y meterse al autoclave durante 2 horas. El material de plástico deberá limpiarse con etanol absoluto y meterse al autoclave durante 45 minutos. Otra posibilidad es tratar el material que se vaya a utilizar con DEPC (inactivador de RNAsas). Es importante que los reactivos que se utilicen en la extracción de RNA se matengan en alícuotas con los volúmenes mínimos necesarios para cada etapa del proceso y en caso de ser posible se pasen dos veces por el autoclave y que se preparen con agua con un 1‰ de DEPC. (se añade 1 ml DEPC a 1000 ml agua miliQ y se deja durante 15 minutos a unos 100ºC. El DEPC inactiva cualquier RNAsa presente. El agua tratada con DEPC debería ser usada para cualquier solución que tanga que ser 2RNAsa free”; después de los 15 minutos, autoclavamos la solución para esterilizarla y romper cualquier residuo de DEPC). La fase inicial de todo análisis de ácidos nucleicos requiere la obtención de la molécula de DNA o RNA en estado puro, libre de otros constituyentes celulares. Para lograrlo se aprovechan las características físico-químicas de la molécula a aislar. Primero hay que estabilizar los ácidos nucleicos, mediente el uso de inhibidores de nucleasas, uso de agua y materiales pre-tratados con DEPC, que inhibe las RNAsas, uso de 1

mercaptoetanol y proteinasa K (para eliminar las proteínas asociadas a los ácidos nucleicos). Extracción de ácidos nucleicos Extracción de DNA La extracción consiste en el aislamiento y purificación de moléculas de DNA y se basa en las características de la molécula. El DNA está constituido por dos cadenas de nucleótidos unidas entre sí formando una doble hélice. Los nucleótidos están integrados por un azúcar (desoxirribosa), un grupo fosfato y una base nitrogenada (adenina, guanina, citosina, timina). La unión de los nucleótidos ocurre entre el grupo fosfato y el azúcar, mediante enlaces fosfodiéster, dando lugar al esqueleto de la molécula. Las bases de cadenas opuestas se unen mediante puentes de hidrógeno y mantienen estable la estructura helicoidal. Los grupos fosfato están cargados negativamente y son polares, lo que le confiere al DNA una carga neta negativa y lo hace altamente polar, características que son aprovechadas para su extracción. Los grupos fosfato tienen una fuerte tendencia a repelerse, debido a su carga negativa, lo que permite disolver al DNA en soluciones acuosas y formar una capa hidratante alrededor de la molécula. Pero en presencia del etanol, se rompe la capa hidratante y quedan expuestos los grupos fosfato. Bajo estas condiciones se favorece la unión con cationes como Na+ que reducen las fuerzas repulsivas entre las cadenas de nucleótidos y permiten que el DNA precipite. Por otro lado, la carga neta negativa del DNA le permite unirse a moléculas y matrices inorgánicas cargadas positivamente. A lo largo del tiempo se han diseñado distintos protocolos con la finalidad de obtener una cantidad y calidad de DNA adecuados, así como garantizar la eliminación de inhibidores potenciales que dificulten el tratamiento posterior de la molécula. Los métodos tradicionales, desarrollados en los años 50, utilizan solventes orgánicos para separar a las proteínas del DNA y, una vez suspendido en la fase acuosa, aislarlo por precipitación con etanol. Estos métodos requieren preparar soluciones y la extracción puede tomar desde unas horas hasta varios días por los numerosos pasos que deben realizarse. En general, los protocolos tradicionales consisten de 5 etapas principales: homogeneización del tejido, lisis celular, separación de proteínas y lípidos, precipitación y redisolución del DNA. A partir de los años 90 se introdujeron al mercado combos o kits de extracción que utilizan matrices inorgánicas compactas cargadas positivamente capaces de retener varios microgramos de DNA y separarlos del resto de las biomoléculas, permitiendo obtener un extracto libre de inhibidores. Los combos se venden en presentación de membranas de sílice o perlas magnéticas, las primeras están formadas por una resina y las segundas consisten de un centro de hierro cubierto por resina. La membrana está

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insertada dentro de un tubo de polipropileno y las microesferas se encuentran suspendidas en una solución amortiguadora. Durante la extracción, el DNA cargado negativamente se adsorbe o une a la matriz selectiva de manera reversible y se mantiene unido a ésta durante la remoción de lípidos, proteínas y metabolitos secundarios, posteriormente, la molécula se libera de la matriz. Los combos también incluyen soluciones de lisis, unión y lavado que no contienen fenol ni cloroformo para extraer proteínas, tampoco requieren etanol para precipitar el DNA. Los kits comerciales disminuyen la extracción a unas cuantas horas porque reducen el número de pasos del procedimiento y, utilizados bajo las recomendaciones de cada proveedor, garantizan una extracción de alta pureza ya que tanto la recuperación del DNA como la eliminación de contaminantes son muy eficientes. PROTOCOLOS DE EXTRACCIÓN TRADICIONAL Y COMERCIAL Colecta de la muestra La colecta de la muestra y su manejo adecuados son indispensables para una extracción del DNA exitosa. Una colecta y manejo apropiado de la muestra permite obtener permite obtener DNA íntegro y sin contaminantes, los cuales afectan la acción de las enzimas durante la reacción de PCR. Homogeneización del tejido La homogeneización, mecánica o química, consiste en romper las uniones entre las células para facilitar la interacción con las soluciones de lisis que ayudan a liberar el material genético. a) La homogeneización mecánica incluye el uso de: Nitrógeno líquido Este procedimiento consiste en macerar la muestra con nitrógeno líquido, en un mortero de porcelana, hasta obtener un polvo muy fino. El nitrógeno líquido, congela de inmediato la muestra y evita que se formen cristales en el interior de la célula que rompen la estructura celular e inicie el proceso de degradación. Este procedimiento se puede utilizar en tejido fresco o congelado. Es importante considerar que si la muestra ya está congelada, se deberá disgregar con nitrógeno líquido para evitar la degradación del DNA por acción de las DNAsas. Pistilos u homogeneizadores Los pistilos disgregan la muestra mediante fricción con la pared del tubo que contiene la muestra, adicionalmente se puede utilizar algún material abrasivo como vidrio 3

pulverizado o resinas. El proceso se realiza manualmente, con pistilos plásticos o con ayuda de dispositivos electrónicos, conocidos como homogeneizadores. Es recomendable adicionar un poco de buffer de lisis antes de iniciar, estas soluciones desnaturalizan proteínas y mantienen estable el DNA. Es necesario colocar el tubo sobre una cama de hielo, lo cual evita que el DNA se fragmente por el calor que genera la fricción. No es recomendable utilizar este método con tejidos congelados, porque las células del interior del tejido se descongelan antes de entrar en contacto con la solución de lisis y el DNA se fragmenta por acción de las DNAsas. En este caso se recomienda que el tejido se disgregue en presencia de nitrógeno líquido. Alternativamente se pueden utilizar buffers comerciales como RNALater, la muestra se sumerge en el reactivo y se mantiene a -20ºC toda la noche, posteriormente se puede descongelar la muestra y macerar sin requerir Nitrógeno líquido. b) Homogeneización química En la homogeneización mediante agentes químicos, la muestra se mantiene en solución a altas temperaturas en presencia de detergentes, proteasas y agentes caotrópicos que rompen las uniones entre las células o que incluso pueden perforar la membrana celular. La disgregación química es recomendable para bacterias, muestras pequeñas de tejidos frescos o sangre. Lisis celular Durante el proceso de lisis las interacciones entre las moléculas que conforman la pared, la membrana celular y nuclear se modifican o destruyen permitiendo que los ácidos nucleicos se liberen. Se utilizan soluciones básicas, detergentes o agentes caotrópicos que permiten disolver la membrana celular, así como inhibidores para inactivar enzimas que degradan el DNA. Muchas soluciones de lisis contienen EDTA, que forma un complejo con los iones de Mg 2+ e impide el funcionamiento de las DNasas. Los componentes celulares no solubles como el material fibroso y proteínas que permanecen en solución se separan del DNA por centrifugación. Tanto la homogeneización como la lisis celular son similares en los protocolos tradicionales y comerciales, el resto de pasos no. 1. PROTOCOLO TRADICIONAL Separación de proteínas y lípidos En esta etapa se separa el DNA de las proteínas y lípidos mediante solventes orgánicos y ciclos de centrifugación. Se utiliza la fuerte tendencia hidrofílica de los grupos fosfato para separarlos en medios acuosos, mientras que las proteínas y los lípidos se separan en solventes orgánicos. La fase acuosa y la orgánica se separan por centrifugación lo que permite aislar el DNA. Los solventes que se usan frecuentemente son el fenol, el 4

cloroformo y el alcohol isoamílico. Estos reactivos contaminan fácilmente el DNA, por lo que se debe evitar acarrearlos en el proceso de purificación. Precipitación del DNA Una vez se han eliminado lípidos y proteínas, se recupera el DNA. Para ello se adiciona etanol y soluciones con altas concentraciones de iones de sodio o amonio que se unen a los grupos fosfato, esta mezcla reduce las fuerzas repulsivas entre las cadenas y permite que el DNA se pliegue sobre sí mismo haciéndolo insoluble. Un paso de centrifugación permite que el DNA permanezca en el fondo del tubo mientras que el etanol es desechado. Los restos de etanol se eliminan con un lavado con etanol al 70% y el remanente se elimina por evaporación. Redisolución del DNA Después de eliminar el etanol, el paso siguiente es hidratar el DNA para mantenerlo en solución. En el caso de emplear agua, el pH debe ser de 7 para permitir la redisolución completa del DNA y evitar una hidrólisis ácida. Cuando se utiliza una solución amortiguadora, es preferible utilizar una solución de Tris-HCl a 10mM y EDTA a 0.1 M a un pH de 8 (low TE) para almacenar el material. Cuando se está disolviendo el DNA es importante evitar el pipeteo y la agitación agresiva pues se pueden fragmentar moléculas de alto peso molecular. Una opción para evitar la fragmentación consiste en incubar a 55ºC el DNA, 1 a 2 horas con agitación suave. 2. PROTOCOLO COMERCIAL Unión del DNA a la matriz inorgánica y lavado En el caso del kit con membrana de sílice, en algunos casos a la mezcla de lisis se le añade la solución de unión que tiene un pH específico. Antes de pasar la solución de lisis a través de la columna, se adiciona etanol a la solución, eliminando la capa hidratante del DNA y exponiendo sus grupos fosfato, facilitando con ello la adsorción de la molécula a la membrana cargada positivamente. Los lípidos y las proteínas no son afines a la membrana y se eliminan con ayuda de la solución de lavado y un ciclo de centrifugación, mientras que el material genético permanece unido a la matriz. El kit con perlas magnéticas además de utilizar soluciones a pH específicos, utiliza un imán o magneto que atrae a las perlas para separarlas de las soluciones en las que se encuentran suspendidas. En este caso, se añade a la solución de lisis una solución amortiguadora a pH ácido que permite cargar positivamente a las perlas, favoreciendo la unión de DNA. Las proteínas y los lípidos tienen baja afinidad por las perlas y son elimininados con soluciones de lavado a pH fisiológico. Las perlas son retenidas en la pared del microtubo con el magneto, mientras que la solución con los contaminantes se eliminan por pipeteo. 5

Recuperación del DNA de la matriz En los kits es necesario eliminar el DNA de la matriz. La membrana y el DNA se deshidratan con soluciones de lavado y ciclos de centrifugación, después se recomienda centrifugar nuevamente la columna para evaporar el etanol y eliminar el exceso de soluciones. Posteriormente, se adiciona agua o solución amortiguadora al centro de la membrana, se espera que el DNA se hidrate, se centrifuga para recuperarlo de la matriz y resuspenderlo. En el protocolo de perlas magnéticas se utiliza una solución básica de Tris-HCl 10mM a pH 8.5 para neutralizar la carga de las perlas. El DNA se separa de las perlas y transfiere a otro tubo, mientras que las perlas continúan siendo retenidas por el magneto. Para análisis de DNA, a veces, es necesario eliminar RNA co-purificado, por eso lo tenemos que tratar con RNAasas. Igual pasa con el análisis de RNA, tenemos que eliminar los restos de DNA con DNAsas. Extracción RNA Método GIPS El método utilizado con más frecuencia es el de GIPS (por sus siglas en inglés; ácido tiosanato de guanidina, fenol, sarcosyl) desarrollado por Chomczynski y Sacchi (1987). Cada uno de estos componentes juega un papel específico: el ácido tiosanato de guanidina es sumamente fuerte y tiene un alto poder desnaturalizante; el fenol, al estar acidificado, provoca que el DNA se acumule en la interfase entre la fase acuosa y la del fenol, dejando al RNA en la fase acuosa; el sarcosyl, por su parte, es un detergente muy potente que ayuda a la lisis celular, pero no reemplaza la ruptura física de las células que generalmente se logra con micro esferas de vidrio agitadas con la ayuda de un vórtex o de un homogeneizador celular. Sin embargo, es importante tratar las muestras con DNAsas libres de RNAsas. Método de extracción fenólica con TRIZOL (Reagent Invitrogen TMLife Technologies) Este método se basa en el uso de una solución monofásica de fenol e isotiocianato de guanidina para la lisis de las células y la separación de la muestra en dos fases (acuosa y orgánica). Seguida de la extracción y precipitación del ARN total con cloroformo e isopropanol respectivamente a partir de la fase acuosa. Cada tejido se molió en un mortero agregando nitrógeno líquido hasta obtener un polvo fino. De este polvo se pesaron de 0.10 a 0.15 g en un tubo de 1.5 ml, y se adicionó 1.0 ml de TRIZOL® (fenolsales de guanidina), el tejido se homogenizó con un homogenizador (Polytron® PT 1200, Kinematica AG). Las aspas del polytron fueron previamente lavadas con NaOH 1.0 N en agua DEPC (dietil-pirocarbonato) 1.0%, y por último con agua DEPC al 1.0%. El tejido homogenizado se centrifugó a 10,000 rpm por 10 min a 4°C; en este paso se 6

eliminan los restos celulares, si la muestra es tejido adiposo se observa un anillo de grasa en la parte superior. El sobrenadante se transfirió a un tubo eppendorf y se adicionaron 200 μl de cloroformo frío, se agitó vigorosamente durante 15 seg. y se incubó en hielo por 3 minutos. Posteriormente la muestra se centrifugó a 10,000 rpm por 10 min a 4°C; en este paso se forman dos fases por diferencia de densidad; la fase fenólica orgánica, contiene al ADN y restos de proteínas desnaturalizadas y la fase superior acuosa contiene el ARN en cloroformo. Esta fase se transfirió a un tubo de 1.5 mly se adicionaron 500 μl de isopropanol el cual precipita al ARN. La pastilla se lavó con etanol al 75%, y se centrífugo por 5 minutos a 7,500 rpm a 4°C (2 veces). En el último lavado, el etanol se eliminó y la pastilla se secó por aproximadamente 5 minutos. Al final, la pastilla de ARN se disolvió en 30 - 50 μl de agua DEPC estéril dependiendo de su tamaño, se agitó en vortex y se tomó una alícuota la cual se almacenó a –20ºC para más adelante cuantificar y determinar la integridad del RNA total. Al resto se le agregó 1/10 del volumen total de acetato de potasio 2.0 M y 2 volúmenes de etanol absoluto y se almacenó a -70°C para los subsecuentes ensayos (RT-PCR’s). Método BOOM El método Boom, desarrollado por Boom et al. (1990) lleva a cabo la extracción con el ácido tiosanato de guanidina, separando los ácidos nucleicos con base a su alta afinidad para enlazarse con matrices de sílica, en vez de utilizar fenol. Dado que este método aisla tanto DNA como RNA, resulta esencial utilizar las nucleasas específicas para DNA que lo eliminen de la muestra. Algunas compañías han creado paquetes de extracción basados en este principio, que utilizan matrices de sílice diseñadas para favorecer el enlace de RNA (RNeasy de Qiagen). Las moléculas grandes de RNA, incluyendo rRNA y mRNA, son insolubles en soluciones con altas concentraciones de sal, por lo que durante su precipitación es común utilizar cloruro de litio 8M (libre de RNAsas) e incubar las muestras durante dos horas antes de centrifugar. Sin embargo, este método no debe utilizarse para RNA que será sometido a transcripción reversa. Tipos de extracción de ácidos nucleicos Métodos convencionales (1) Extracción Guanidina tiocianato-fenol-cloroformo La sal es la impureza más común en las muestras de ácidos nucleicos. Los pasos generales de purificación de los ácidos nucleicos incluyen lisis celular, que rompe la estructura celular para crear un lisado, inactivación de las nucleasas celulares, como la 7

DNAsa y la RNasa, y separación del ácido nucleico deseado del resto celular. Los solventes orgánicos –la extracción fenol-cloroformo es uno de los ejemplos- son los más comúnmente utilizados para aislar ácidos nucleicos. Aunque el fenol puede desnaturalizar proteínas rápidamente, no inhibe completamente la actividad RNAsa. Este problema se puede solucionar utilizando una mezcla de fenol:cloroformoisomilalcohol (25:24:1). Proteínas, lípidos, carbohidratos y los restos celulares son eliminados a través de la extracción de la fase acuosa con la mezcla orgánica de fenol y cloroformo. Una emulsión bifásica se forma cuando se añaden fenol y cloroformo después de la centrifugación, la fase hidrofóbica (fondo) y la hidrofílica (parte superior). La parte superior es la que contiene el DNA y, una vez recuperada, el DNA puede ser precipitado añadiendo etanol o isopropanol y una alta concentración de sal. Una vez precipitado el DNA, el exceso de sales se lava con etanol 70%, centrifugamos para eliminar este etanol y el resto lo dejamos evaporar. Una vez tenemos el pellet limpio de sales y sin etanol, lo disolvemos con agua estéril o tampón TE. El uso de guanidina isotiocianato-fenol-cloroformo se utiliza para la extracción de RNA. La guanidina isotiocianato es un agente caotrópico utilizado en la degradación de proteínas. El principio de esta técnica es que el RNA es separado del DNA después de la extracción con una solución ácida consistente en guanidina isotiocianato, acetato sódico, fenol y cloroformo. En condiciones ácidas, el RNA total permanece en la fase acuosa, mientras que el DNA y las proteínas se quedan en la interfase o en la fase orgánica del fondo. La recuperación del RNA total se hace por precipitación con isopropanol. (2) Método de extracción alcalina La lisis alcalina ha sido utilizada para aislar DNA plasmídico. Esto funciona bien con todas las cepas de E. coli y con cultivos bacterianos que van de un volumen de 1ml a 500ml en presencia de Sodium Dodecyl Sulfa...