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MADURACION DE LOS RNA La maduración de los RNA son procesos postranscripcionales en los que se produce una modificación de los RNA para que sean funcionales. Transforman el RNA primario en una molécula de ARN maduro .Una molécula de RNA recién sintetizado se denomina transcrito primario. En procariotas se tienen que modificar los RNAt y los RNAr (los RNAm surgen directamente ya maduros, pudiendo acoplarse directamente la transcripción con la traducción). En eucariotas todos los RNA han de sufrir procesos de maduración. Se produce dentro del núcleo y solo cuando se completa es cuando los RNAm salen del nucleó hacia el citoplasma donde desarrollan su función. Los RNA que han de sufrir procesamiento postranscripcional, (tanto en procariotas como en eucariotas) se liberan del complejo de transcripción de una forma NO totalmente activa y sufren modificaciones hasta adquirir sus estructuras maduras.

Estas modificaciones postranscripcionales se clasifican en tres tipos generales: 1) Eliminación de algunas primario. (Presentes en el ADN)

secuencias

del

transcrito

2) Adición de secuencias al transcrito primario de RNA, no codificadas en el DNA. 3) Modificación covalente de ciertas bases nitrogenadas del tránscrito (metilación, desaminación o reducción). Muchas de estas reacciones están catalizadas por RNA: RNA catalíticos o ribozimas. PROCARIOTAS: Los procariotas posen genes continuos, no contienen intrones. (Las regiones promotoras no aparecen en el transcrito, pero si forman 1

parte del gen!!) Un polipéptido esta codificado por una secuencia de DNA que es colineal con la secuencia de aminoácidos. Hay segmentos del DNA (5’UTR y 3’UTR) que son transcritos junto con el resto del gen por las RNA polimerasas, pero no son traducidos. Por lo tanto están presentes en el transcrito primario pero NO en el polipéptido final.

EUCARIOTAS: La mayoría de los genes en eucariotas son discontinuos: la secuencia codificante se encuentra interrumpida por secuencias que no codifican el polipéptido final (intrones). Lo intrones son bastante más grandes que los exones excepto los genes que codifican para histonas, los cuales no poseen intrones. Hay segmentos del DNA (intrones, 5’UTR y 3’UTR) que son transcritos junto con el resto del gen por las RNA polimerasas. TODOS están presentes en el transcrito primario, los intrones desaparecen en el RNA maduro aunque las regiones 5’UTR y 3’UTR permanecen en él, pero NO aparecen en el polipéptido final. MADURACION DE LOS RNAm EUCARIOTAS: El procesamiento de los RNAm eucariotas conlleva 3 procesos principales: 1. Modificación del extremo 5’: unión covalente de una estructura denominada casquete. Les protege de procesos que pudieran degradar ese RNA. 2. Modificación del extremo 3’. En el extremo 3’ la RNA polimerasa siempre adiciona nucleótidos de más, este RNA extra se corta y al extremo 3’ se le adicionan entre 80 y 250 residuos de adenilato (cola poli A). 3. Splicing (ayuste): corte de los intrones y empalme de los exones. Los intrones se eliminan del transcrito primario y los exones se unen para formar una secuencia continua. En el momento que ocurre en la célula no hay una separación temporal entre estos procesos de maduración, pero sí podemos decir que la aparición del casquete en 5’ es de los primeros en aparecer. ADICION DE LA CAPERUZA 5’: El ARNm inmaduro contiene el primer nucleótidos trifosfatado, y suele ser un ATP o un GTP. Se une a un residuo de 7-metilguanosina mediante el 5’ terminal del RNAm mediante un enlace 5’,5’trifosfato. Se trata de una modificación covalente que conduce la 2

incorporación de un nucleótido protector sobre el NTP en posición 5’ terminal del RNA normalmente purico (ATP o GTP). A menudo se producen metilaciones en las posiciones 2’-OH del primer y segundo nucleótido adyacentes al casquete. La adición del casquete se produce en las primeras fases de la transcripción, después de añadir los 20-30 primeros nt del tránscrito primario. Todos los enzimas implicados en este proceso se encuentran asociados al dominio C-terminal de la RNA polimerasa II (CTD) fosforilado, hasta que se sintetiza el casquete. FUNCIONES DEL CASQUETE: - protege el extremo 5' del RNA de la acción de exonucleasas y fosfatasas - marca el pre-mRNA para su empleo posterior como sustrato en otras reacciones de procesamiento en el núcleo - se une al complejo proteico CBC para facilitar la fijación del mRNA al ribosoma para iniciar la traducción. FORMACION DE LA COLA DE POLI-A

La mayoría de los mRNA eucariotas poseen en su extremo 3' una serie de 80-250 residuos de adenilato denominada cola de poli(A) (variable en el numero de A, y cuyo tamaño está implicado en la vida media del ARNm y de la función que este desempeñara). FUNCIÓN: - Sirve de sitio de unión a proteínas específicas que protegen el mRNA de la degradación enzimática - aumenta la eficacia de la traducción. La adición de la cola de poli(A) conlleva varias etapas: 1. Durante la transcripción el transcrito primario se extiende más allá del sitio donde se tiene que añadir la cola de poli A. Esta región es cortada por una riboendonucleasa que forma parte de un gran complejo enzimático asociado con el dominio Cterminal (CTD) de la RNA polimerasa II. 1. El complejo enzimático reconoce una secuencia señal muy conservada 5’-AAUAAA-3’ situada 10 a 30 nt en el lado 5’ del sitio de corte.

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2. El corte genera un extremo 3’-OH libre al que se añaden inmediatamente los residuos adenilato por la enzima poliadenilato polimerasa que cataliza la reacción: RNA + Natp à RNA-(AMP)n + nPP

CORTE DE INTRONES Y ELIMINACION DE EXONES: SPLICING Existen cuatro grupos de intrones según su ubicación en distintos genes y de características concretas del mecanismo de maduración. Grupos I y II: son intrones de autocorte y empalme (AUTOMADURACION) (no necesitan enzimas ni gasto de ATP para realizar el splicing). En ambos casos el corte y empalme incluye dos reacciones de trans-esterificación (son en sí mismos RNA catalíticos o ribozimas). El proceso está catalizado por el propio RNA que alberga a estos intrones. Los de grupo I están presentes en algunos genes que codifican par RNAr(nucleares mitocondriales y de cloroplastos), RNAm bacteriófagos y RNAt bacterianos. Los de grupo II están presentes en los transcritos primarios de RNAm de orgánulos, rRNA, tRNA de mitocondrias cloroplastos hongos, algas bacterias y plantas. -

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Grupo III: es el grupo más números de intrones. Presentes en los precursores nucleares del RNAm eucariota. Su eliminación depende de un gen complejo RNA-proteína especializado denominado espliceosoma (formado por ribonucleoproteína nucleares pequeñas denominadas snRNP). En este caso son necesarios enzimas y gasto energético. Pero el gasto energético es para la formación del complejo que corta el intrón, no para el corte en sí.

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Grupo IV: son intrones presentes en ciertos tRNA. El corte está mediado por una endonucleasa (con gasto de ATP) que corta los enlaces fosfodiester de cada extremo del intrón y los dos exones se unen por un mecanismo similar al de la DNA ligasa. Estas endonucleasas son enzimas totalmente distintas a las enzimas del Grupo III.

SPLICING EN INTRONES DEL GRUPO III Es el grupo más numeroso e incluye los intrones presentes en la mayoría de los transcritos primarios del mRNA nuclear de eucariotas. El corte y empalme de estos intrones requiere la participación de ribonucleoproteínas nucleares pequeñas (snRNP). Estas ribonucleoproteínas contienen, cada una de ellas, un RNA de 100-200 nt denominado RNA nuclear pequeño (snRNA) y cerca de 10 proteínas. 4

La eliminación de los intrones del grupo III viene determinada por secuencias presentes en el interior de los mismos: son tres, dos en los extremos 5’ y 3’ y otra en su interior. Estas secuencias marcan el sitio de corte y empalme. La eliminación de los intrones de este grupo, a pesar de lo grandes que son, no está dirigida por el tamaño del intrón, es decir, no hay diferencias en el proceso de splicing en función del tamaño del intrón. En el caso de los intrones de los RNA m eucariotas las secuencias GU en el 5’ y AG en el 3’son las responsables del reconocimiento del complejo de corte. Estas dos bases en cada extremo son las que más conservadas aparecen y las que directamente interaccionan pero los nucleótidos adyacentes facilitan esta unión, por eso es toda la región la que especifica donde se produce el corte. Aunque la mayoría de los intrones en el genoma humano albergan las secuencias GU-AG en los centros de ayuste, existen excepciones en los que aparecen las secuencias AU-AC.

La unión de las snRNP con los mRNA primarios conduce a la formación de un voluminoso complejo llamado espliceosoma (ayustosoma) dentro del cual tiene lugar la reacción de corte y empalme. Este complejo es necesario tanto para el reconocimiento de los puntos de escisión como para llevar a cabo una reacción catalítica que hace que los intrones se eliminen y los RNA se puedan unir. Se requiere ATP para su formación pero NO para la reacción de splicing. Los RNAsn catalizan las reacciones de trans-esterificación: ribozimas

Interaccionan la ribonucleoproteína U1 con la región 5’ (GU) mediante el apareamiento de bases del ARN de la ribonucleoproteína con las secuencia complementaria del intrón. La U2 se une con el centro de ramificación (A) al que luego se unirán la U4, U5 y U6 formando un lazo en el intrón quedando el extremo 5’, el centro de ramificación y el extremo 3’ próximos y que se produzca un ataque nucleofilico. Se produce las reacciones de transesterificacion y se libera el intrón en forma de lazo.

Tanta importancia tienen estas secuencias que la modificación por una mutación en alguna de las bases que flanquean los intrones, hace que el intrón no sea eliminado y de lugar a una proteína que no pueda

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traducirse y se quede como elemento abortivo o dé lugar a una proteína no funcional. La diferencia con el proceso anterior es que aquí son necesarias moléculas que aproximen los intrones o las regiones del intrón o lo que sea, porque este es el proceso que ocurre en los intrones más grandes (preg.ex). Los tres procesos de maduración del ARNm (caperuza en 5’, cola de poliA en 3’ y corte de intrones y empalme de exones) tienen lugar en el proceso de transcripción, gracias al dominio CTD de la RNA polimerasa II fosforilado. Esto permite coordinar el proceso de corte y empalme y el de transcripción. El dominio C-terminal fosforilado de la RNA polimerasa II es esencial para: 1.- Organizar la modificación del extremo 5’: incorpora las enzimas que añaden el casquete del transcrito primario del mRNA. 2.- Coordinar los elementos del espliceosoma: componentes de la maquinaria de maduración

asocia

3.- Coordinar la formación de la cola de poli (A) del mRNA: interacciona con la endonucleasa que degrada el mRNA exponiendo el sitio de poliadenilación.

PROCESAMIENTO ALTERNATIVO DEL RNAm Los transcritos primarios pueden ser modificados de varias maneras para producir diferentes proteínas: el proceso de maduración de los RNAm mediante corte y empalme se lleva a cabo de otra forma, resultando un corte y un empalme distintos. La elección de un proceso de maduración u otro depende del tipo de tejido (tiroides-cerebro), del estado del desarrollo, distinto estado celular (Ig), distinto momento fisiológico…. Se trata de proteínas que proceden del mismo gen, producen el mismo transcrito primario pero difieren en forma y función debido al distinto procesamiento del RNAm. Maduración diferencial de un mismo transcrito primario que produce 2 hormonas diferentes en humanos: en el tiroides produce la calcitonina (regulación niveles de calcio y fósforo) y en el cerebro produce la CGRP (vasodilatador-transmisión del dolor). (Foto página anterior). El corte de intrones y empalme de exones es diferente, varía dependiendo del tejido (ej. tiroides y cerebro), lo que en uno suponen zonas no codificantes (intrones) para otros tejidos si lo son, y viceversa. 6

No se consideran genes policistrónicos, los genes eucariotas son genes monocistrónicos ya que ese término hace referencia al tránscrito primario no al producto funcional. Otro ejemplo es la formación de la Ig En un tipo celular determinado la ruta de maduración de un RNAm depende de los factores de maduración que estén presentes. Los factores de maduración son proteínas de unión al RNA específicas de tejido que promueven una ruta de procesamiento determinada. El splicing alternativo contribuye a la diversidad funcional y estructural de los productos génicos. Para los eucariotas pluricelulares complejos (entre otros los mamíferos) el procesamiento alternativo de los mRNA lleva a la formación de diferentes órganos y se considera esencial en la aparición de nuevas especies. El corazón como ejemplo de órgano complejo. Se da un tipo de maduración dependiendo del momento de desarrollo del individuo. RIBOEDICION DEL RNA: Es un proceso que tiene lugar después de la maduración postranscripcional, en el ARNm maduro. La acción de este proceso se ve reflejada en la traducción. Se produce una modificación en las bases de tránscrito maduro, ej. desaminación de las bases del RNA

Ejemplo: Riboedicion en la apolipoproteina B: una modificación en las bases da lugar en el hígado a LDL y VLDL y en el intestino delgado da lugar a los quilomicrones: (en la foto esta cambiado!!!) En el intestino delgado la citidina desaminasa produce un cambio de base de CAA->UAA (codón de STOP) sintetizando una proteína más pequeña también con función en el transporte de lípidos.

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MADURACION DE LOS RNAr PROCARIOTAS Y EUCARIOTAS Los RNAr tanto en procariotas como en eucariotas se forman a partir de precursores más largos llamados RNA prerribosomicos (pre-rRNA)

PROCARIOTAS 



 



EUCARIOTAS

Un RNA prerribosomico 30s es procesado para der los rRNA 16S, 23S y 5S (y algunos RNAt poco frecuentes). En la maduración se eliminan fragmentos de ambos extremos del precursor 30S y segmentos entre los distintos rRNA. Antes del corte el precursor 30S es metilado en bases especificas (rayitas rojas) A continuación varias RNasas (endonucleasa) realizan el corte en sitios específicos de manera secuencial (RNasa III, RNasa P y RNasas E) obteniendo los tipos S de productos funcionales y algún ARNt (no sucede en eucariotas) El genoma del E. Coli contiene 7 copias del precursor 30S que solo difieren entre si en las regiones codificantes de los tRNA.

Un RNA prerribosómico 45S es procesado en el nucleolo para dar los rRNA 18S, 28S y 5,8S, característicos de los ribosomas eucariotas. Antes del corte, el precursor 45S es metilado en más de 100 nt específicos. Posteriormente, una serie de snoRNPs realizan cortes enzimáticos para producir los RNA maduros. El RNAr 5S de la mayoría de los eucariotas es sintetizado como un tránscrito independiente por la RNA Pol III. No es sometido a procesamiento.

FORMACION DE RIBOSOMAS: Los ribosomas están formados por RNAr y proteínas. La formación de los mismos va acompañada de la obtención de loa ARNr maduros. La formación de los ribosomas, comienza en el nucléolo donde el ensamblaje de las pre-subunidades ribosomales se asocia a la transcripción y maduración del rRNA. Continua en el nucleoplasma, sale del núcleo y madura definitivamente en el citosol. 8

Los ribosomas de las células eucariotas contienen cuatro diferente moléculas de RNA ribosómico (rRNA). La subunidad mayor (60S) contiene los rRNAs 28S, 5.8S y 5S, y la subunidad menor (40S) contiene el rRNA 18 S. Las tres moléculas, 18S, 5.8S y 28S son sintetizadas en el nucleolo. El 5S es sintetizado por la RNA polimerasa III fuera del nucleolo, en otra región del nucleoplasma. Los rRNAs maduros se combinan en el nucleolo con las proteínas ribosómicas para formar las subunidades ribosomales pre-40S y pre-60S.(unidades ribosomales=ARNr+proteínas ribosomales sintetizadas en el citoplasma). Las proteínas ribosomales se forman en el citoplasma paralelamente a la formación (transcripción y maduración) de los RNAr, que cuando está listo las proteínas prerribosomales han de encontrarse en el interior del núcleo para ensamblarse con él. Estas son exportadas a través los poros nucleares (NPCs) al citoplasma, se termina la maduración y se forman las subunidades ribosómicas 40S y 60S maduras funcionalmente que constituyen los ribosomas 80S. La maduración de la pre-subunidad mayor 60S sigue una ruta diferente de la menor 40S. PROCESAMIENTO DEL tRNA EN PROCARIOTAS Y EUCARIOTAS En ambos casos, los tRNA proceden de precursores más largos que sufren eliminación enzimática de nucleótidos en los extremos 5' y 3'. En 5’ poseen una secuencia líder que será eliminada por una endonucleasa. En el extremo 3’ necesitamos un triplete CCA para que los RNAt maduros rindan su función(unión al aminoácido) Las RNasas implicadas en este proceso son: - Endonucleasa RNasa P: es una ribonucleoproteína que elimina una secuencia líder de RNA del extremo 5' del tRNA. Este enzima constituye otro ejemplo de RNA catalítico o ribozima. - Exonucleasa RNasa D: junto a otras nucleasas se encarga del procesamiento del extremo 3' de los tRNA. Después del corte los tRNA son modificados mediante la tRNA nucleotidiltransferasa que añade un trinucleótido CCA al extremo 3' del tRNA. Eliminan las secuencias que hubiera y añaden CCA.Este es un paso fundamental en el procesamiento de todos los tRNA eucariotas y de algunos tRNA bacterianos que carecen de esta secuencia.

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Los tRNAs eucariotas también experimentan numerosas modificaciones en la ribosa y en algunas de las bases del resto del tRNA, por metilación, desaminación o reducción, de forma que en el tRNA maduro abundan bases infrecuentes que no son habituales en otros ácidos nucleicos . Esto produce un aumento en la vida media de los tRNAs y aumenta la variedad de reconocimiento entre la maquinaria y los tRNAs(mayor especificidad). A diferencia de los procariotas, en los eucariotas hay múltiples copias de muchos de los genes de tRNA y sus tránscritos presentan ocasionalmente intrones(aproximadamente 14 pb) que deben ser eliminados. El corte y empalme de estos intrones (catalizado por una endonucleasa y una ligasa) constituye la última etapa del procesamiento de los tRNA eucariotas.

VIDA MEDIA DE LOS RNA La tasa de degradación de los mRNA de los diferentes genes son muy variables (de segundos, a minutos o incluso horas): - En procariotas la vida media del mRNA es muy corta (90 seg) porque son RNA que apenas sufren procesos de maduración y no presentan estructuras 2arias. (Menor complejidad en forma de vida) - En eucariotas la vida media de un mRNA es de ~ 3 horas porque, aunque no presentan estructuras 2arias, son procesados postranscripcionalmente (cola de poli(A) y casquete 5') (mayor complejidad del organismo, transcripciones mas largas) La tasa de degradación de los rRNA y tRNA es mucha más lenta (horas o incluso días) ya que presentan estructuras 2arias (trébol) y también sufren procesamientos postranscripcionales . Además los rRNA se unen a proteínas ribosómicas que les dan mayor estabilidad. DEGRADACION DEL RNAm El contenido celular de un determinado mRNA dependerá de 3 factores: su velocidad de síntesis, de su procesamiento y su velocidad de degradación en el citoplasma. Las vías de degradación de los mRNA se pueden dividir en dos clases: - mecanismos de control de calidad que eliminan la producción de proteínas potencialmente tóxicas (proteínas truncadas que no son funcionales, como defecto en la maduración del RNAm)

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- los mecanismos que alargar o acortan la vida media del mRNA modificando la abundancia de proteínas funcionales (control mediante retroalimentación). Las estructuras que estabilizan el mRNA frente a la degradación son: Estructura en horquilla presente en mRNA bacterianos con terminación independiente del factor rho y Cola de poli(A) y casquete 5' en mRNA eucariotas. En procariotas una endonucleasa produce unos cuantos cortes en el mRNA que son seguidos...