Organizzazione RNA MESS PDF

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struttura, maturazione, funzione, ribozima, cap 5', coda di poli A, proteine che interagiscono...

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ORGANIZZAZIONE DELL’RNA messaggero In seguito alla produzione del messaggero, l’RNA maturo contiene al suo interno quella che sarà la sequenza da tradurre in proteina, non tutto il messaggero è codificante, infatti la sequenza ORF quella codificante è contenuta all’interno ed è delimitata da delle sequenze (codone di inizio e codone di stop), mentre le ragione che stanno a monte (5’UTR) e a valle (3’UTR), regione trascritta ma non tradotta. Il codone di inizio AUG per la metionina, nel codone di stop sempre sequenza nucleotidiche che determina lo stop della traduzione e il disassemblamento del ribosoma e al rilascio della proteine e dell’RNA messaggero per ulteriori cicli. RNA messaggero: -

Eucariote, MONOCISTRONICO, la traduzione porta alla sintesi di un’unica catena polipeptidica Procariote, POLICISTRONICO, a livello genomico esiste una sequenza controllata da un unico promotore che regola, trascrive e traduce più geni ORF, con un unico messaggero.

Il codice genetico è la decodifica delle sequenze nucleotidiche che vanno a definite un codone in un amminoacido. Ogni codone specifica un a.a. distinto e separato. 3 ribonucleotidi sono sufficienti a definire un codone che a sua volta è sufficiente a definire un a.a. Il codice genetico è DEGENERE, ovvero considerando la varia combinazioni 4^3, si ottengono 64 possibili combinazioni nucleotidiche che vanno a costituire i codoni, ma gli a.a. sono 20, quindi UNO STESSO A.A. Può ESSERE SPECIFICATO DA CODONI DIVERSI. VANTAGGIO IN TERMINI DI MUTAZIONI PERCHE’ QUALORA UN A.A. VENGA SPECIFICATO DA PiU’ CODONI E SI VERIFICA UNA MUTAZIONE A LIVELLO DEL RIBONUCLEOTIDE A QUESTO PUNTO LA MUTAZIONE VIENE DEFINITA SILENTE, IN QUANDO IN SEGUITO A MUTAZIONE NON A’ VARIATO L’A.A. PRODOTTO. IL CODICE NON E’UNIVERSALE, un codone che normalmente porterebbe a un codone di stop, nel mitocondrio viene considerato come un codone per il TRIPTOFANO, lo stesso per isoleucina e metionina; anche nei lieviti capire e altri organismi. REGOLE DEL CODICE GENETICO: viene letto senza sovrapposizioni di codoni, nel momento in cui il codone di inizio AUG viene identificato tutta la sequenza da quel momento in poi viene letta a 3 a 3 in sequenza, cosa importante perché una mutazione va a modificare solo la produzione di un a.a., in caso ci fosse uno slittamento comporterebbe in seguito a mutazione la produzione di più a.a. scorretti. Non ci sono intervalli, in seguito al riconoscimento del ribosoma, lui legge le triplette tutta una tirata, dal codone di inizio a quello di stop. La sintesi delle proteine è lineare e avviene in direzione N-terminale -> C-terminale. LA DECODIFICA dell’informazione che avviene a livello dell’RNA non avviene in modo spontaneo, ma richiede l’intervento di una molecola adattatore, tRNA. Molecola di corte dimensioni, con una sua porzione riesce a riconoscer il codone, l’altra è in grado di associarsi ad un a.a. specifico, entrambi i legami sono eventi importanti nella decodifica e fedeltà del processo.

STRUTTURE SECONDARIA E TERZIARA, la struttura secondaria definita a trifoglio è una struttura non esistente nella cellula, la struttura secondaria evolve portando alla formazione della struttura L capovolta terziaria. Partendo dal 5’-3’ ci ritroviamo una porzione a stelo definita STELO ACCETTORE, importante determina il legame con l’a.a., a seguire troviamo il BRACCIO D, con una serie di basi insolite, scendendo troviamo l’ANSA DELL’ANTICODONE che contiene un trinucleotide particolare responsabile del riconoscimento del codone, spostandoci verso il 3’ ci ritroviamo l’ANSA VARIABILE la cui lunghezza in termini di ribonucleotidi dipende dagli organismi, fino ad arrivare all’ANSA TPSIC, importante nel riconoscimento dell’a.a. da aggiungere fino a ritornare all’inizio dove alla fine in 3’ troviamo una sequenza ribonucleotidica importante AAC tutti terminano cosi, importante è l’adenosina terminale perché a quel livello del ribosio dell’adenosina verrà legato all’a.a. COME INTERAGISCE IL RNA TRANSFER CON IL MESSAGGERO RNA Il transfer riesce a decodificare il messaggero associando alla tripletta un a.a. come lo fa? La possibilità di riconoscere il codone in maniera specifica avviene grazia all’ansa dell’anticodone presente nella struttura del TRNA, in particolare a una sequenza trinucleotidica, la regola affinchè un transfer possa legarsi al messaggero è che l’anticodone sia complementare e antiparallelo al codone. Si formeranno dei legami idrogeno che permettono al tRNA di riconoscere e permanere li, solo a quel punto il tRNA partecipa alla sintesi proteica, è stato notato che l’anticodone non sia completamente complementare, alcune basi non sono strettamente associate, come l’uracile, il suo partner canonico sarebbe l’adenina è stato notato che può formare legami idrogeno con la guanina, e quindi porta riconoscere codoni differenti, lo stesso dicasi per la guanina, anche in questo caso il tRNA potrà riconoscere due codoni diversi, la condizione necessaria è che questi diversi codoni possono specificare per la stessa proteina, altrimenti verrebbe inserito un a.a. diverso. Anche L’INOSINA deaminazione dell’adenina, quindi una base insolita e forma legami idrogeno con citosina, timina e adenina, e quindi può riconoscere codoni diversi che codificano per lo stesso a.a. è questo riguarda solo la prima base azotata, andando a studiare la struttura dell’anticodone.

VACILLAMENTO DELL’ANTICODONE O DELLA TERZA BASE, la regione evidenziata in rosso fanno parte dell’anticodone i tre nucleotidi necessari e viene evidenziato anche il 4 nucleotide che non fa parte dell’anticodone, sempre letto in direzione 5’-3’, la base che può vacillare è la prima, da un punto di vista strutturale è giustificato per una questione di impilamento. le quattro basi sono rivolte tutte verso lo stesso lato e di solito sono purine che presentano due anelli. La seconda e la terza base dell’anticodone, si vengono a formare delle interazioni fra la basi che danno poca facoltà di movimento alla seconda e terza base, obbligando a formare dei legami canonici, cosa che non succede con la prima base perché non è soggetta all’interazione e formare legami di tipo canonico. Nella fedeltà si tiene infatti considerazione della seconda e terza base dell’anticodone, sistema per il riconoscimento del codone. COME L’AMMINOACIDO SI LEGA A LIVELLO DELLO STELO ACCETTORE: Il legame avviene a livello della adenosina che costituisce l’ultimo ribonucleotide in posizione 3’, questo processo è catalizzato dall’enzima: FAMIGLIA AMMINOACIL TRNA SINTETASI: -

CLASSE 1 MONOMERICHE, caricare a livello del 2’OH; CLASSE 2 DIMERICHE O TETRAMERICHE, caricare a.a. a livello del 3’OH.

Queste proteina hanno un compito delicato, ovvero devono riconoscere l’RNA transfer e devono riconoscere l’a.a. specifico che deve essere legato al transfer. Come l’a.a. viene legato e riconosciuto? MECCANISMO DI CARICAMENTO DEL TRNA, una volta riconosciuto il TRNA, la regione ad L dello stelo accettore, si va a posizione nel sito attivo dell’enzima ed è qui che avviene il caricamento dell’a.a. In due fasi, che avvengono a livello del sito attivo dell’enzima, la prima è l’attivazione dell’a.a. prevede il consumo di ATP, si forma AMMINOACIDO-AMP, l’attivazione è uno step che precede il caricamento vero è proprio a livello del ribosio 2’ o 3’, dipende dall’amminoacil tRNA sintetasi. Un’altra funzione dell’enzima, oltre a riconoscere il tRNA corretto, ma anche l’a.a. corretto. una prima selezione dell’a.a. avviene in funzione delle caratteristiche chimiche dell’a.a. stesso, una seconda è fatta in funzione degli a.a. appartenenti alla stessa classe, anche in base alla dimensione, come una PRE FILTRO.

I RIBOSOMI: ribonucleoproteina, hanno un coefficiente di sedimentazione differente tra procarioti ed eucarioti. 70 S(sverberg, dipende dalla velocità di sedimentazione della particella integra sottoposta a ultra centrifugazione e dalla conformazione). Costituito da due subunità che si possono dissociare e associare in maniera ciclica, abbiamo due subunità: -

Procarioti: 70S una subunità 50S e una subunità 30S Eucariote: 80S una subunità 60S e una subunità 40S.

RNA ribosomiale è importante, costituisce la massa del ribosoma, il principale costituente, ed è quello che conferisce la tipica struttura a ribosoma. Andando a studiare la subunità maggiore ribosomiale nei procarioti, è venuta in evidenza il fatto che la porzione responsabile della formazione del legame peptidico, sito attivo, vedeva una maggiore concentrazione dell’RNA, mentre le proteine andavano a ricoprire un ruolo marginale, distale sulla parte periferica della subunità maggiore ribosomiale. Tra le proteine presenti, quella che si avvicinava di più era la L27 e si pensava potesse essere responsabile della formazione del legame peptidico, in realtà successivamente in seguito ad esperimenti si noto che anche in assenza del sito attivo della L27 il legame peptidico avveniva ugualmente con una velocità inferiore. L27 non è responsabile del legame, ma essere coinvolta nella stabilizzazione del sito attivo della subunità maggiore. L’unica proteina potenzialmente coinvolta era marginalmente. Da un punto di vista strutturale il ribosoma è costituito due subunità: -

Nella maggiore abbiamo il sito catalitico della ribonucleoproteina, quello che porta alla formazione del legame peptidico; Nella minore, centro di decifrazione Le due subunità vanno a delimitare un solco, che andrà ad ospitare il messaggero. andando ad analizzare la struttura del ribosoma, durante il processo di sintesi, avremo l’introduzione del messaggero a livello del solco, che avrà affinità solo per messaggero lineari a singolo filamento. RNA MESSAGGERO può assumere strutture complesse che potrebbero in qualche modo alterare la decodifica, il messaggero associato viene essere linearizzato. La presenza di molecola di RNA TRANSFER in cui l’anticodone si va a depositare a livello della subunità inferiore prendendo contatto con il messaggero, invece lo stelo accettore si posizione a livello della subunità maggiore.

Un altro canale importante è quello dell’uscita della catena polipeptidica in seguito alla sintesi, anche qui è stato notato la dimensione del canale è tale che l’unica struttura compatibile nascente è quella ad alfa elica, le altre strutture potranno essere assunte una volta fuoriuscite.

Le due subunità vanno a generare tre siti specifici, ogni sito può ospitare una molecola di RNA TRANSFER che ha caratteristiche differenti l’una dalla altre. Ovvero la funzione che il tRNA va a svolgere. Da destra a sinistra: -

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Sito A, ospita AMMINOACIL TRNA carico con il corrispondente a.a. andrà a prendere posto a livello del sito; Sito P, PEPTIDIL TRNA ospita una molecola di tRNA che trova associato ad esso il peptide nascente, quindi porta con sé la proteina che si viene a formare Sito E, exit, andrà ad ospitare il TRNA DEACILATO, quindi che ha perso a.a. che peptide.

Come si vanno ad associare? La porzione dello stelo accettore, localizzato a livello del sito PEPTIDIL TRASFERASICO sito catalitico tiene le molecola di tRNA a una distanza compatibile alla formazione del legame peptidico, il ribosoma aiuta le molecole di tRNA ad essere molto vicine fra loro per fare avvenire la reazione peptidil transferasica e la formazione del legame peptidico. A livello della subunità minora, il ribosoma è in grado di mantenere il messaggero disteso, ma anche curvato in maniera tale che il codone sia ben esposto così da permettere al tRNA di riconoscere il codone.

FASE DI INIZIO: nei procarioti sappiamo che il processo della sintesi avviene cotrascrizionalmente, traduzione massiva ovvero più ribosomi traducono più messaggeri, generando i POLISOMI. PROCARIOTI: affinchè possa iniziare occorre che subunità siano separate, che sia presente un messaggero e sia presente una molecola di RNA TRANSFER carico di metionina, il primo codone in tutti i RNA messaggeri è il codone che specifica per la proteina. Il tRNA che interviene in questa fase è singolare, rispetto a quello che viene usato per processo di allungamento; fra i due tRNA vi saranno della caratteristiche strutturali diverse, quello della fase di inizio infatti viene specificato come tRNA INIZIATORE. La subunità minore, forma il complesso di pre-inizio che si associa al messaggero, e il codone di inizio che sarà riconosciuto dall’tRNA iniziatore deve andare a legarsi a livello del sito P, quando si forma l’appaiamento fra codone e anticodone, si andrà a legare la subunità maggiore e si può passare all’allungamento. LEGAME DEL MESSAGGERO RNA ALLA SUBUNITA’ RIBOSOMIALI MINORE: il legame è semplice e immediato nei procario, è stato notato che andando ad esaminare diverse sequenza nucleotidiche degli organismi che la sequenza 5’ UTR hanno una sequenza specifica, RBS (ribosome binding sequences) o SHINE-DALGARNO. questa sequenze risulta essere complementare e antiparallela alla porzione 3’dell’RNA RIBOSOMIALE 16 SVERBERG (l’unico rna ribosomiale che troviamo a livello della subunità inferiore procariotica) fra le basi si formano i legami idrogeni fra messaggeri, garantendo il legame del messaggero alla subunità minore, un altro compito importante svolto dalla rna 16S riguarda il posizionamento del tRNA INIZIATORE nel sito P, una distanza da 6-9 nucleotidi della SHINE-DALGARNO è presenta una sequenza AUG, distanza spaziale tale che intercorre tra l’interazione della SHINE-DALGARNO e il sito P. quindi ricapitolando la SHINE-DALGARNO garantisce il posizionamento del messaggero sulla subunità inferiore, ma anche il posizionamento e l’indirizzo sull’emisito P del codone di inizio. Il tRNA INIZIATORE, chiamato così perché ha una struttura diversa rispetto a quello utilizzato nelle fase di allungamento. Riconosce l’AUG che specifica per la metionina, nel procarioti è stato notato che la metionina non è libera, ma grazie l’intervento di una TRANSFORMILASI viene ad essere formilata. il gruppo carbossilico risulta legato all’tRNA e il gruppo amminico è libero. Si presume che la modificazione sia legata a inattivare il gruppo amminico, la presenza dell’aggiunta del gruppo formilico a livello dell’amminoterminale in realtà rende poco reattivo il gruppo amminico, e la reazione non è reversibile, nelle proteine mature infatti mancano della metionina, esiste una proteasi specifica che la va ad eliminare. Il tRNA deve essere portato a livello della subunità minore e per fare questo occorrono delle proteine, vengono detti FATTORI DI INIZIO, IF, sono 3 nei procario: IF 1 ,2 ,3. Sono state ben caratterizzate e si sa dove vanno ad interagire: - IF 3, è un fattore anti-associativo, si lega a livello del sito E mascherandolo, fino a quando IF3 è legato alla subunità minore, la subunità maggiore non si potrà legare. - IF1, si lega a livello del sito A, che dovrebbe ospitare l’amminoacil tRNA, in questa fase iniziale si vede l’interazione di una proteina, impedisce al tRNA iniziatore di legarsi al SITO A. - IF2, GTPasi, permette una volta associato al tRNA INIZIATORE l’inserimento sulla sito P.

Nei procarioti non esiste un ordine di ingresso. Nel momento in cui si forma l’appaiamento codoneanticodone, la subunità minore subisce un cambiamento conformazionale che determina il rilascio di IF3, permettendo l’associazione con la subunità maggiore. IF 1, IF2 dovranno essere eliminati, grazia all’attività GTPasica, interviene una regione, sempre costituito da RNA RIBOSOMIA 23S che si chiama centro di legame del fattore, quando entra in contatto con fattori proteici va a stimolare l’attività GTPasica, idrolizzando GTP e rimane GDP così da perdere affinità la IF2 con il tRNA iniziatore e si stacca e porta con sé IF1. Così rimarranno le subunità associate, i siti A ed E liberi, il sito P presenterà il tRNA iniziatore associato tramite il legame codone-anticodone con il messaggero. NEGLI EUCARIOTI, il processo è più complesso richiederà l’intervento di più subunità proteiche, queste saranno coinvolti fattori che dovranno mantenere le subunità separate, mantenere i siti A ed E non disponibili e garantire il legame dell’RNA messaggero alla subunità minore, poiché manca la sequenza SHINE-DALGARNO. Il posizionamento del messaggero non può avvenire tramite una semplice interazione RNA-RNA, sono proteina che funzionano da ponte per interazione con la subunità minori. In questo caso abbiamo una sequenzialità di eventi: il mantenimento della forma dissociate delle subunità ribosomiali si può realizzare grazie a 2 fattori EIF3, EIF1, EIF5. -

EIF1, EIF5 sono importanti come fattori antiassociativi, la loro presenza impedisce alla subunità di legarsi, altra funzione è quella di mantenere non disponibile il sito E.

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EIF1A, fattore che si lega al SITO A, impendendo che questo possa essere utilizzato A livello della subunità minore sarà importante l’interazione con il tRNA INIZIATORE, non arriva a livello della subunità minore da solo, ma grazie a un fattore EIF2, ha un’altra affinità di legame con il tRNA iniziatore quando a sua volta è associato al GTP, si viene a formare un complesso costituito dal tRNA iniziatore carico con la metionina, EIF2 GTP, può associare alla subunità minore a livello del sito P. Lo step successivo è il legame dell’RNA MESSAGGERO, che non si associa direttamente ma richiede proteine, e si parla di complesso EIF4F, costituito da 4 subunità che hanno una funzione specifica, il CAP 5’ è un elemento importante per il legame del messaggero, viene riconosciuto da una proteina specifica EIF4E che fa parte del complesso proteico EIF4F; EIF4F è una proteina ponte, nel senso che unisce il CAP e permette l’associazione del messaggero alla subunità minore del ribosoma, permette la circolarizzazione del messaggero e può interagire con le POLI A BINDING PROTEIN presenti e legati alla coda di poli a del messaggero, importante per l’efficienza del processo stesso, può agevolare il processo di re inizio della sintesi. Altre subunità del complesso sono EIF4A ed EIF4B: -

EIF4A, rna elicasi, ATP dipendente va ad eliminare potenziali strutture secondarie che si formano a livello del messaggero EIF4B.

L’INIZIO CAP INDIPENDENTE, ovvero il messaggero può essere privo di cap, possiedono una sequenza specifica a livello del 5’ UTR che porta ad una struttura secondaria particolare che permette di essere riconosciuto da EIF4G. individuati nei messaggeri VIRALI, ma anche endogeni quelli apoptotici.

Siccome il legame del messaggero alla subunità minore non posiziona il codone di inizio a livello del SITO P, ma il codone di inizio deve essere trovato, fase di SCANNING dove il messaggero viene scansionato alla ricerca di AUG, viene trovato perché ogni volta che l’RNA messaggero si sposta, in realtà di tRNA iniziatore che è già presente a livello del sito P tende a cercare il codone di inizio andando a cercare i legami idrogeno. Una volta avvenuto il legame codone-anticodone determina un cambiamento conformazionale della subunità e i fattori proteici devono essere eliminati, il primo fattore ad uscire dal complesso è EIF1, determinando un cambiamento conformazionale a livello del EIF5 siccome è associato alla EIF2 interagisce con EIF2 andando a stimolare l’idrolisi di GTP per rendere meno affine il legame di EIF2, uscendo fuori dal complesso, di conseguenza già avremo una condizione che permette l’associazione delle subunità, ma l’unione delle due subunità oltra alla fuori uscita dei fattori, richiede l’introduzione di un’altra proteina A PRO ASSOCIATIVO EIF5. Gli altri vengono eliminati, tramite il centro di legame del fattore, l’attività GTPasica compie il tutto. FASE DI ALLUNGAMENTO: prevede l’aggiunta di amminoacidi in risposta alle sequenze e informazioni contenute a livello del messaggero. PROCARIOTI: ci ritroviamo nel momento in cui il tRNA iniziatore si è legato, a livello del sito A è stato messo in evidenza un nuovo codone, un RNA TRASFER carico con il giusto a.a. dentro a livello del sito A, se il tRNA è quello corretto, lo step successivo è la formazione del legame peptidico. E si ha uno spostamento del peptide da un tRNA all’altro, quello che è necessario che tutto il messaggero si sposti in modo tale che un nuovo codone sia disponi...