Microscopia N° 04-visualización de paredes y células PDF

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Uso de un microscopio virtual, sus modelos y formas de calibrar...

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PRACTICA N° 04 MICROSCOPÍA COMPETENCIA ➢ ➢ ➢ ➢

Reconoce las partes del Microscopio Se familiariza con el uso del Microscopio Observa muestras a través de un Microscopio virtual Reconoce las Células procariotas y eucariotas INTRODUCCION El microscopio es un instrumento óptico, constituido por un sistema de lentes que permite obtener una imagen aumentada de un objeto no visible al ojo desnudo. La imagen puede ser fotografiada u observada directamente. Para poder usarlo correctamente se necesitan algunos conocimientos básicos relativos a sus partes, cierta habilidad y adiestramiento. En microscopia se manejan tres parámetros importantes para entender la teoría del microscopio. PODER DE RESOLUCIÓN (PR): Es la capacidad que tiene el microscopio (o el ojo humano) de percibir por separado dos puntos pequeños, adyacentes y cercanos. Es la capacidad para revelar detalles bien definidos de unos puntos situados muy cerca uno del otro en el objeto, y poder distinguir imágenes puntuales y totales. Es una medida cualitativa, por lo que no podemos expresarla como un número. El PR aumenta a medida que disminuye la distancia. El PR es inversamente proporcional al límite resolutivo. El límite resolutivo del ojo es 1/10 mm o 100 μm y del microscopio 0,2 μm o 200 nm. LÍMITE RESOLUTIVO (LR): Es la distancia mínima que debe existir entre dos puntos para que sean distinguidos por separado, comprenderemos la relación inversa que se establece entre el poder y el límite resolutivos, depende de la longitud de onda de la luz (λ) que se emplee, así como también de la apertura numérica de las lentes. (AN), ósea cuanto menor sea la distancia que debe separar dos puntos para que se distingan por separado, mayor será el poder resolutivo necesario para observarlos. • El límite de resolución depende de la AN y de la longitud de onda de la luz empleada. Límite de Resolución = λ (ANobj. + ANcond.) = λ / (2AN) • El Límite de resolución máximo que se consigue en los microscopios de campo luminoso se sitúa entre 0,22-0,25 μm.

APERTURA NUMÉRICA (AN): Es una expresión matemática que describe la forma en que la luz es concentrada por el condensador y captada por el objetivo. AN = nSen α Donde: n= Índice de refracción del medio entre las lentes y la muestra. (1,0 para el aire; 1,56 para el aceite) Sen α = Ángulo formado por el eje óptico y los rayos de luz más externos que son captados por el objetivo. Teniendo en cuenta que el seno de α, no puede exceder de 1, y que el índice de refracción de los mejores lentes no puede ser superior a 1,6, usando aceite de inmersión, y usando luz monocromática violeta (400 nm), se tiene que el menor límite resolutivo que se puede obtener es de 170 nm (0,17μm), si usamos luz blanca de la mínima distancia que veríamos, sería de objetos separados 250 nm. Fundamento óptico del microscopio compuesto Se basa en producir una imagen más grande, virtual e invertida. La imagen que observamos es una composición de las imágenes proyectadas por dos lentes principales el objetivo y el ocular.

FORMACIÓN DE LA IMAGEN EN EL MICROSCOPIO COMPUESTO

DETERMINACIÓN DEL AUMENTO DE OBSERVACIÓN Cuando se indica el poder de amplificación tanto en el objetivo como en el ocular, se multiplica el aumento del ocular por el aumento del lente objetivo, en posición de observación y el producto es el aumento total. Eje. Ocular = 10X Objetivo = 40X Aumento = 400X PARTES DEL MICROSCOPIO ÓPTICO El microscopio óptico consta de 3 sistemas: Mecánico, óptico e iluminación

A) SISTEMA MECÁNICO Constituida por los siguientes dispositivos: 1. CABEZAL: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular, binocular, dentro de él se encuentra el TUBO ÓPTICO, un cilindro de metal en cuya parte superior se encuentra colocado el ocular y en la parte inferior el revólver, al cual se atornillan los objetivos. 2. BRAZO: Es de metal macizo en forma de C. Por su parte anteroposterior se une con el tubo óptico y por su extremo inferior se conecta con la base del microscopio o pie. En su extremo inferior se encuentra el tornillo macrométrico y micrométrico los cuales se utilizan para movilizar el cabezal rápidamente (enfoque grosero) y para movimientos lentos (Enfoque fino), respectivamente. 3. PLATINA: Es una plataforma de forma cuadrada, rectangular o circular que se encuentra fija en parte anterior e inferior del brazo. Se utiliza para colocar la preparación a observarse. Presenta una abertura central denominada apertura de la platina, cuyo fin es dejar pasar los rayos luminosos proyectados de la fuente de luz, además posee presillas o pinzas que permite sujetar la lámina o portaobjetos. 4. REVOLVER: Es un dispositivo giratorio que está unido a la parte inferior del tubo óptico y posee dos, tres o más roscas donde se atornillan los objetivos. Este revólver al hacerlo girar debe disponerse en el retén, los objetivos, indicando que se encuentra en posición de observación. 5. SISTEMAS DE DESPLAZAMIENTO DE LA MUESTRA: Sistemas de cremalleras que permite el desplazamiento de la muestra de atrás hacia delante o viceversa y de derecha a izquierda o viceversa. 6. BASE, PIE O ESTATIVO: Tiene forma de herradura o circular, y sirve de apoyo al microscopio, debiéndose colocar sobre una superficie plana y horizontal. 7. TORNILLOS DE ENFOQUE: El macrométrico y el micrométrico permiten el enfoque primario con el objetivo de menor aumento de la imagen y la focalización fina de ésta. B) SISTEMA ÓPTICO: 1. OCULARES: Son cilindros cortos y huecos que se colocan en la parte superior del tubo óptico. Interiormente poseen dos o tres lentes, uno a cado extremo. La lente superior se denomina lente ocular y la inferior lente de campo. En la parte externa de estos lentes se indica el poder de amplificación 4X, 10X, 15X, etc. Son llamados oculares porque el ojo del observador se coloca en este lugar. 2. OBJETIVOS: Son tubos cortos atornillados al revolver. El objetivo es un sistema de lentes de los cuales el que está más cerca al objetivo se encuentra en la parte externa del mismo: 4X, 10X, 20X, 40X 100X, etc. Este último es el

objetivo de inmersión que se usa con aceite de cedro. A este dispositivo se le denomina lente objetivo porque está ubicado cerca del objeto y forma una imagen real, invertida y más grande. C) SISTEMA DE ILUMINACIÓN: 1. CONDENSADOR: Se encuentra debajo de la platina y tiene como función concentrar los rayos luminosos sobre la preparación y puede moverse acercándose o alejándose de ésta por medio de un tornillo. 2. DIAFRAGMA: Ubicado en la parte inferior del condensador. Es un disco circular que permite regular la cantidad de luz proyectada a la apertura de la platina 3. LUZ: La fuente de luz se encuentra instalada en el pie.

PARTES DEL MICROSCOPIO MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO 1. Para su transporte se levanta siempre con una mano por el brazo y con la otra se coge por la base. 2. Limpie previamente los objetivos con papel lente. Estando el instrumento en posición vertical, oriéntelo hacia la fuente luminosa y regule la entrada de luz con el diafragma.

PARA REALIZAR EL ENFOQUE: 1. La lámina con la muestra a observar es ubicada sobre la platina sujetándola con las pinzas. Las láminas deben estar completamente secas para no mojar las piezas del microscopio. 2. Comenzar la observación con el objetivo de 4x (panoramico) y luego colocar el de 10 aumentos (10x) 3. Acercar al máximo la lente del objetivo a la preparación, empleando el tornillo macrométrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a través del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparación pudiéndose dañar alguno de ellos o ambos.

4. Mirando, ahora sí, a través de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la preparación con el macrométrico y, cuando se observe algo nítido la muestra, girar el micrométrico hasta obtener un enfoque fino. 5. Pasar al siguiente objetivo. La imagen debería estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover un poco el micrométrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdió por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operación desde el paso 3. El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparación y por ello es fácil que ocurran dos tipos de percances: incrustarlo en la preparación si se descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con aceite de inmersión si se observa una preparación que ya se enfocó con el objetivo de inmersión. EMPLEO DEL OBJETIVO DE INMERSIÓN: 1. Bajar totalmente la platina. 2. Subir totalmente el condensador para ver claramente el círculo de luz que nos indica la zona que se va a visualizar y donde habrá que echar el aceite. 3. Girar el revólver hacia el objetivo de inmersión dejándolo a medio camino entre éste y el de 40X. 4. Colocar una gota mínima de aceite de inmersión sobre el círculo de luz. 5. Terminar de girar suavemente el revólver hasta la posición del objetivo de inmersión. 6. Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta que la lente toca la gota de aceite. En ese momento se nota como si la gota ascendiera y se adosara a la lente. 7. Enfocar cuidadosamente con el micrométrico. La distancia de trabajo entre el objetivo de inmersión y la preparación es mínima, aun menor que con el de 40X por lo que el riesgo de accidente es muy grande.

8. Una vez se haya puesto aceite de inmersión sobre la preparación, ya no se puede volver a usar el objetivo 40X sobre esa zona, pues se mancharía de aceite. Por tanto, si desea enfocar otro campo, hay que bajar la platina y repetir la operación. 9. Una vez finalizada la observación de la preparación se baja la platina y se coloca el objetivo de menor aumento girando el revólver. En este momento ya se puede retirar la preparación de la platina. Nunca se debe retirar con el objetivo de inmersión en posición de observación. 10. Limpiar el objetivo de inmersión con cuidado empleando un papel especial para óptica. Comprobar también que el objetivo 40x está perfectamente limpio. MANTENIMIENTO Y PRECAUCIONES 1. Al finalizar el trabajo, hay que dejar puesto el objetivo de menor aumento en posición de observación, asegurarse de que la parte mecánica de la platina no sobresale del borde de esta y dejarlo cubierto con su funda. 2. Cuando no se está utilizando el microscopio, hay que mantenerlo cubierto con su funda para evitar que se ensucien y dañen las lentes. Si no se va a usar de forma prolongada, se debe guardar en su caja dentro de un armario para protegerlo del polvo. 3. Nunca hay que tocar las lentes con las manos. Si se ensucian, limpiarlas muy suavemente con un papel de filtro o, mejor, con un papel de óptica. 4. No dejar el portaobjetos puesto sobre la platina si no se está utilizando el microscopio. 5. Después de utilizar el objetivo de inmersión, hay que limpiar el aceite que queda en el objetivo con pañuelos especiales para óptica o con papel de filtro (menos recomendable). En cualquier caso, se pasará el papel por la lente en un solo sentido y con suavidad. Si el aceite ha llegado a secarse y pegarse en el objetivo, hay que limpiarlo con una mezcla de alcohol-acetona (7:3) o xilol. 6. No forzar nunca los tornillos giratorios del microscopio (macrométrico, micrométrico, platina, revólver y condensador). 7. El cambio de objetivo se hace girando el revólver y dirigiendo siempre la mirada a la preparación para prevenir el roce de la lente con la muestra. No cambiar nunca de objetivo agarrándolo por el tubo de este ni hacerlo mientras se está observando a través del ocular. 8. Mantener seca y limpia la platina del microscopio. Si se derrama sobre ella algún líquido, secarlo con un paño. Si se mancha de aceite, limpiarla con un paño humedecido en xilol. 9. Es conveniente limpiar y revisar siempre los microscopios al finalizar la sesión práctica y, al acabar el curso, encargar a un técnico un ajuste y revisión general de los mismos.

I. MATERIALES • Guía de prácticas • Simulador • Fotografías de celular eucariotas y procariotas II.PROCEDIMIENTO Uso del Simulador del Microscopio: • Acceder al simulador del microscopio en el siguiente enlace: http://www1.udel.edu/biology/ketcham/microscope/scope.html

1. Observación de la letra “e” • • • • • • • • •

Luego seguir los procedimientos indicados en la casilla “getting started” realizar las observaciones y dibujar los elementos observados Una vez concluido el tour de inicio elegir la lamina de la letra “e” Ubicar la muestra usando adecuadamente la platina y cambiar el modo de visión a través del botón “Switch Views,” ajustar los oculares. Elegir el objetivo de menor aumento 4X y enfocar usando los tornillos macrométrico y micrométrico. Regule el condensador para cambiar la cantidad de luz que pasa a la muestra Anotar las observaciones en los recuadros para rellenar de esta práctica. Cambiar de aumento al objetivo 10X. Anotar las observaciones. Cambiar el modo de vista con “switch view”, regresar la lámina. 2. Observación de la punta de raíz de cebolla

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Colocar la lámina de raíz de cebolla, centrar en la platina. Enfocar la muestra con el objetivo 4X. Anotar las observaciones. Cambiar de aumento a 10X. Anotar las observaciones. Luego cambiar a 40X. Anotar las observaciones. Cambiar el modo de vista con (switch view) devolver la lámina. 3. Observación de bacterias

• Colocar la lámina de bacterias y siguiendo el procedimiento anterior, observar con los aumentos 4X, 10X, 40X y 100X, Anotar las observaciones. • Devolver la lámina 4. Observación de células epiteliales de raspado de la mejilla • Siguiendo el paso anterior colocar la lámina de células epiteliales, observar con los objetivos de 4X, 10X, 40 X y anotar las observaciones.

ELEMENTO OBSERVADO

IMAGEN O DIBUJO

DESCRIBIR SUS CARACTERISTICAS

Observación de Células procariota y eucariota Acceder al siguiente enlace, observar las imágenes y anotar las observaciones: https://microscope-microscope.org/microscope-resources/microscope-links/

IMAGEN O DIBUJO

DESCRIBIR SUS CARACTERISTICAS

II. CUESTIONARIO. 1. Identifique todas las partes del microscopio LECTURA COMPLEMENTARIA: https://www.elsevier.com/es-es/connect/medicina/celulas-eucariotas-y-procariotassabrias-distinguirlas-te-damos-las-claves...