Meios de Montagem em Microscopia Óptica PDF

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Métodos e técnicas em citologia e fisiologia ...

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Textos de apoio à Disciplina de

Métodos e Técnicas em Citologia e Fisiologia

Notas técnicas sobre diversos Meios de Montagem utilizados em Microscopia Óptica

António Xavier Pereira Coutinho Departamento de Ciências da Vida da FCTUC Coimbra, 2016

1. Breves referências sobre alguns meios de montagem utilizados em Microscopia Óptica

Introdução Com frequência, após a realização das necessárias etapas do Método Histológico Normal, há vantagem em tornar definitivas as preparações. Para tal, utilizam-se Meios de Montagem, que são substâncias que, ao incluir os materiais biológicos, os preservam de ser danificados pelo contacto com a atmosfera (oxidações) e com microorganismos (bactérias, fungos). Muitos desses meios, ao secar, tornam-se sólidos. Alguns, no entanto, continuam no estado líquido (mais ou menos viscoso), e, consequentemente, devem ser Lutados (selados), ou seja, rodeados por uma segunda substância (como a parafina ou o verniz de unhas) que, ao secar, se torna mais ou menos sólida, selando, assim, a preparação. O seu índice de refracção deve ser próximo do do vidro, para evitar perda de raios luminosos portadores de informação (i. e. que atravessaram as células) por refracção. Exemplos de meios de montagem a) Euparal – Este meio de montagem, muito utilizado em microscopia, foi inventado, em 1904, pelo Prof. G. Gilson, da Universidade de Lovaina. Consiste de uma solução, em etanol, de um conjunto de substâncias naturais extraídas de árvores diversas. Dessas substâncias, as mais importantes são o Sandarac (uma resina obtida a partir da Thuja articulata, uma conífera da família das Cupressaceae), o Eucaliptol (extraído, como o seu nome indica de eucaliptos) e a Cânfora (obtida a partir da espécie Cinnamomum canfora (L.) J. Presl., da família das Lauraceae). O Euparal só pode ser utilizado com material em cujo tratamento final foi utilizado etanol absoluto, pois turva se for posto em contacto com xilol, clorofórmio, etc. Este meio de montagem tem a vantagem de ser transparente, mas a sua secagem é lenta, podendo demorar muitas horas. Outro inconveniente do Euparal é que, ao longo do tempo (por vezes 1-2 anos), tende a descorar um tanto o material biológico nele imerso, uma vez que muitos corantes são solúveis em álcool etílico. Também pode, por vezes, originar bolhas de ar no seu seio, embora isso seja raro.

b) Bálsamo do Canadá – Outro meio de montagem clássico, usado de há muito em microscopia óptica, e, também, de origem vegetal, é o Bálsamo do Canadá, que consiste numa mistura de diversas resinas [na sua maior parte provenientes do abeto Abies balsamea (L.) Mill., uma conífera espontânea da América do Norte, pertencente à família das Pinaceae] dissolvidas, geralmente, em Xilol (embora outras substâncias, como o Benzeno ou o Clorofórmio, também possam ser utilizadas). Este meio de montagem conserva bem as cores do material nele imerso e não causa o aparecimento de bolhas de ar nas preparações, embora confira um tom vagamente amarelado – a sua cor natural - às preparações. No entanto, tal como o Euparal, o Bálsamo do Canadá tem uma secagem lenta, e, como é bastante viscoso, é comum a colocação de pequenos pesos de chumbo em cima da lamela. Também a separação da lamela é bastante difícil (levando, muitas vezes, à quebra das preparações), embora se possa utilizar xilol para esse efeito. Este meio de montagem, por conter xilol na sua composição, é incompatível com a água, turvando em contacto com ela, pelo que o material biológico deve ser prévia e cuidadosamente desidratado.

c) DPX – O DPX (ou DePeX - cuja sigla significa, em inglês, Distrene Plasticiser Xylene), um meio de montagem sintético, é utilizado há bastante menos tempo que os dois exemplos anteriores. Consiste numa solução neutra de poliestirenos em xilol. É perfeitamente transparente, muito fluido (espalhando-se, facilmente, com uma pequena pressão, sob a lamela) e seca rapidamente (2-3 horas, em estufa a 25 ºC). No entanto, ao ser colocado, pode apresentar tendência a formar pequenas bolhas de ar, as quais, se não forem cuidadosamente expulsas, multiplicam-se, inutilizando a preparação. Pelas mesmas razões acima apontadas para o Bálsamo de Canadá, é incompatível com a água, devendo os cortes histológicos ser cuidadosamente desidratados antes do contacto com o meio de montagem. d) Óleo de Silicone - Esta substância, composta por polisiloxanos (i. e. polímeros líquidos compostos por cadeias de átomos alternados de oxigénio e silício que, habitualmente, também incluem, secundariamente, átomos de carbono e hidrogénio) é utilizada como um lubrificante para diversos tipos de máquinas, também pode ser usada como meio de montagem (por exemplo, para grãos de pólen, esporos e diatomáceas).

Apresenta as vantagens de ser muito transparente, pouco viscoso (espalha-se facilmente) embora, tal como os dois meios anteriores, turve em contacto com a água, o que implica que o material biológico deve ser cuidadosamente desidratado antes da montagem. O facto do óleo de silicone se manter, permanentemente, no estado líquido, leva a que, ao contrário do que sucede nos três casos anteriores, o material possa ser rodado mediante a aplicação de uma pressão suave à lamela. Isso implica, no entanto, a que as preparações tenham que ser lutadas da forma descrita na introdução. Apresenta alguma reacção com diversos lutantes (parafina, verniz de unhas) e, em geral, não conserva o material durante tanto tempo como outros meios (p. ex. Bálsamo do Canadá ou Gelatina Glicerinada). e) Gelatina Glicerinada – Tal como os casos anteriores, também a gelatina-glicerinada é um meio de montagem bastante usado em microscopia óptica. Existem diversas fórmulas de preparação, utilizando, em proporções variáveis, gelatina, glicerol e água destilada. Muitas usam, também, uma pequena quantidade de fenol, para evitar a proliferação de microorganismos (p. ex. 65 g de gelatina, 20 ml de glicerol, 60 ml de água destilada e 5 ml de fenol). A riqueza em água deste meio de montagem torna-o próprio para objectos biológicos cujas características (p. ex. a forma) estejam dependentes do grau de hidratação. É este o caso, por exemplo, dos grãos de pólen e esporos. A gelatina glicerinada tem um índice de refracção inferior ao do vidro, pelo que as preparações que a utilizam são um pouco menos claras que as que usam meios de montagem à base de resinas (p. ex. Bálsamo do Canadá, Euparal e DPX).Tal como sucede com muitos outros meios de montagem não resinosos (p. ex. o óleo de silicone), é necessário lutar a lamela para obter preparações definitivas....