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Prüfungsfragen Montag, 26. Oktober 2015

15:14

1. Initiation der Translation bei Prokaryoten? ○ Die anti-Shine-Dalgarno-Sequenz der rRNA bindet mit der Shine-Dalgarno-Sequenz auf der mRNA, ○ Weiters erfolgt die Bildung des Initiationskomplex durch Interkation der mRNA + Ribosomen + fMet -tRNA + drei Intiationsfaktoren

2. Southern Blotting? Ablauf wie und was wird nach gewiesen? Southern Blotting weißt spezifische DNA-Fragmente nach! a. Auftrennung der dsDNA-Fragmente auf Agarosegel dsDNA-Fragmente, auf Agarosegel, werden elektrophorisch der Größe nach aufgetrennt. (dsDNA-Fragmente: Bei Spaltung mit Restriktionendonukleasen entstanden)

b. Blotting der DNA-Fragmente auf Blatt Das Agarosegel liegt auf einem Schwamm, welcher in einem alkalischen Puffer sitzt. Ein Blatt Nitrocellulose/Nylonmembran wird auf das Gel gelegt. Auf dieses Blatt kommen Papiertücher, welche den alkalischen Puffer ansaugen und somit auch die DNA -Fragmente vom Agarosegel auf das Blatt übertragen. Außerdem werden bei diesem Vorgang die dsDNA -Fragmente, durch den alkalischen Puffer, zu ssDNA-Fragmenten denaturiert. c. Abziehen des Blattes (mit fest gebundenen ssDNA-Fragmenten darauf) d. Hybridisierung der markierten DNA-Sonde mit der aufgetrennten DNA Das Blatt (mit ss-DNA-Fragmenten darauf) wird einer radioaktiv markierten DNA-Sonde (für die gesuchte DNA-Sequenz, z.B. durch das 32P-Isotop markiert) ausgesetzt. Unter hybridisierungsbegünstigten Bedingungen in einem Plastiksack inkubiert. e. Waschung und Visualisierung Die markierte DNA-Sonde hybridisierte nun mit den komplementären DNA-Banden. Wir entfernen das Blatt aus dem Sack und waschen es gründlich, damit nur die Sondenmoleküle (+ DNA-Banden) auf dem Papier zurückbleiben. Nach der Autoradiographie erscheinen die mit der radioaktiven Sonde hybridisierten DNA -Moleküle als Bande auf dem Autoradiogramm.

3. Northern Blotting? Ablauf wie und was wird nach gewiesen? Nothern Blotting weißt spezifische RNAs nach. Funktioniert gleich wie Southern Blotting, jedoch mit gewissen Unterschieden: a. RNA wird ungeschnitten auf einem denaturierendem Agarosegel mit Formaldehyd aufgetrennt, welchen die Bildung von Sekundärstrukturen unterbindet. b. Nachweis über Hybridisierung mit einer markierten anti-sense DNA-Sonde. (Weil RNA-DNA-Hybride sind stabiler als DNA-DNA-Hybride, d.h. bei der Hybridisierung muss mit höherer Temperatur und/oder weniger Salz gearbeitet werden.) c. RNA ist viel empfindlicher! Bei allen schritten wird mit speziell behandeltem Wasser gearbeitet bzw. in Lösungen gearbeitet, welche auf Proteine stark denaturierend wirken! Hauptfeind: RNAsen.

4. Western Blot Western Blotting weißt spezifische Proteine nach! a. Auftrennung der Proteine per SDS-PAGE-Gelelektrophorese Ein Proteingemisch, wird per SDS-PAGE, entsprechend ihrer Größe und Ladung in Protein-Banden aufgetrennt. =>Proteine wandern zur Anode! b. Electro-Blotting der Protein-Banden auf eine Membran (Nitrocellulose/PVDF) Um die Proteine weiter bearbeiten zu können, müssen sie vom Gel auf eine Nitrocellulose/PVDF -Membran geblottet werden. Dieser Vorgang wird Elektroblotting genannt, wobei man sich eine gewissen Stromstärke zu Nutze macht um die Proteine auf die Membran zu übertragen. (Früher war es auch üblich, wie bei der Southern/Nothern -Blot-Methode das blotten durch die Kapillarkräfte von darüber liegenden Papiertüchern zu erreichen, dies dauert aber sehr lange.) => Hier wandern wieder die Proteine zur Anode Richtung Membran. c. Abziehen der Membran (mit fest gebundenen Proteinen darauf) Nach dem Transfer (SDS-PAGE + Blot) d. Inkubation mit Erst-Antikörper Die Membran wird danach mit Erst-Antikörper inkubiert. => danach wird die Membran gründlich gewaschen e. Inkubation mit Zweit-Antikörper (Detektionsantikörper) Die Membran wird mit Zweit-Antikörper, welche mit einem speziellen Enzym verbunden sind, inkubiert. Diese binden spezifisch an den Erst-Antikörpern. f. Waschung und Visualisierung Nach der Waschung werden die Enzym, welche beim Zweit-Antikörper gebunden sind, mit einem passenden Substrat zu einer Farbreaktion gebracht.

5. Warum kommen in einigen Organismen weniger G/C als A/T vor? CpG Inseln?

6.

a. Aufgrund der Desaminierung von MethylCytosin in Thymin, bei der DNA -Modifikation, sind G/C-Folgen unterrepräsentiert. b. CpG-Inseln entstehen durch Mechanismen, die mit der Nutzung der Erbsubstanz als Informationsträger zu tun haben. Aus diesem Grund sind CpG-Insel wichtige Markierungen für Genetik/Medizin/Bioinformatik. i. Denn da das relativ häufige Gene sind, kommt es hier nie zu methylierung, da man sie dadurch inaktivieren würde. ii. Vorsicht: CpG-Inseln dürfen nicht mit den GC-Boxen, welche vor Beginn des Transkripts liegen, verwechselt werden! Was sind polyklonale Antikörper? Wie hergestellt? Einsätze von polyklonale AK - Methoden beschreiben. a. reines Antigen -> [Injektion des Antigens in einen Host] + [Blutentnahme] -> Test des Serums auf Bildung von spezifischen AKs -> [falls nicht erfolgreich: WIEDERHOLUNG] | [falls erfolgreich: Entnahme größerer Blutmengen mit AKs im Serum] Antikörper werden von B-Zellen produziert, dabei sind diese gegen verschiedene Epitope (Bereich einer Antigenoberfläche) gerichtet. Das heißt, der Antikörper erkennt zwar sein Antigen, jedoch nicht jeder Antikörper erkennt es auf die gleiche Art und Weise. Aus B-Zelle-1 kommt ein Antigen, welches eine bestimmte Substruktur erkennt, aber der AK von B-Zelle-2 hergestellt erkennt eine andere Substruktur, sie erkennen beide das gesuchte Antigen, jedoch auf andere Art und Weise. => Das ist für das Immunsystem sehr günstig, da die AK dadurch weniger spezifisch sind und das Immunsystem mit diesen polyklonalen AK auch noch nützlich ist, falls es zu Mutationen kam. => Herstellung ist im Gegensatz zum monoklonalen AK einfacher, da man z.B. eine Maus die gewünschten Antikörper bilden lässt, ihr dann die gewünschten B-Zellen entnimmt. => In der Forschung greift man jedoch auf monoklonale AK zurück, da man sich sonst nie sicher sein kann ob z.B. der AK geradeauf das gesuchte Protein reagiert oder nur auf eine ähnliche Struktur bei einem anderen Protein.

7. Erläutern Sie das Meselson-Stahl-Experiment als Grundlage der semi-konservativen DNA-Replikation.

• konservativen Replikation Mutter-DNA bleibt vollständig erhalten Kopien ihrer beiden Einzelstränge ergeben neuen Doppelstrang. semikonservativen Replikation bleibt die MutterDNA in jedem Tochter-Molekül zur Hälfte erhalten. AKTUELL disperse Replikation verläuft im Prinzip ähnlich, auch hier bleibt in jeder Tochter-DNA die Hälfte der Mutter-DNA erhalten, die andere Hälfte wird durch neue Nucleotide ersetzt. Allerdings ist der Ersetzungsmechanismus ein völlig anderer - denn die Nucleotide der Mutter-DNA wechseln sich hierbei mit den neu hinzukommenden Nucleotiden ab.

Forscher züchteten durch ein Nährmedium, welches nur 14N-Isotope enthielt, Bakterien, bauten dieses leichtere Isotop in ihre DNA ein. Danach wurde die Bakterien auf ein Nährmedium mit nur 15N-Isotope aufgebracht. Nach eine gewissen Zeit wurde die • Nachfolgegeneration (F1) entnommen und ihr Erbgut einer Dichtegradientenzentrifugation unterzogen. ○ Es zeigte sich, dass die Sedminationsebene der F1-Bakterien-DNA genau zwischen den Ebenen der Bakterien lag, welche • ausschließlich 14/15N-Isotope enthielten. DADURCH AUSSCHLUSS DER KONSERVATIVEN THEORIE Um zu entscheiden, welche der übrig gebliebenen Theorien richtig sei, wurde der Vorgang mit der F2-Generation wiederholt. Dabei ergab sich, dass sich das Erbgut diesmal zu 50 % bei der F1-Ebene und zu 50 % bei der 14N-Ebene befand. ○ Somit Beweis: SEMIKONSERVATIV! (Für dispers, hätte es zw. F1-Ebene und 14N-Eben sein müssen!)

8. Extrachromosomale Vererbungswege bei Pflanzen? Vererbung von Plastiden vom Cytoplasma aus und folgt nicht den Mendel'schen Vererbungsregeln. Bei manchen Pflanzenarten findet sie maternal statt, aber auch biparental und paternal sind möglich!

9. Centromere: Aufbau und Funktion? Eingeschnürte Region eines Chromosoms. => Hoher Anteil an Satelliten-DNA, d. h. Tausende aufeinanderfolgende kurze Sequenzen aus 5–10 Basenpaaren. => Entspricht auch der Stelle auf der DNA, an der sich die Kinetochoren bilden, an dem die Mikrotubuli aus der Mitosespindel andocken.

10. Telomere: Aufbau und Funktion? Was ist eine Telomerase? Enden eines Chromosoms

Einf. i. d. Molekularbiologie Seite 1

=> Charakteristisch für seine Sequenzwiederholungen (Säugetieren: TTAGGG | höhere Pflanzen: TTTAGGG | Ciliata: TTGGGG). => Sie schützen die Chromosomen sich bei jedem Replikationszyklus zu verkürzen. Jedoch verkürzen sich Telomere bei jeder mitotischen Zellteilung und somit wird ein indirekter Zusammenhang mit Alterung vermutet. (Aber auch mit Krebs usw.) => Telomerase: Ein Enzym, welches die Sequenzwiederholungen bei Telomere verlängert und somit die Verkürzung während der Zellteilung wieder ausgleichen kann.

11. DNA-Polymerase-1: Nenne die 3 Funktionen! a. Entfernt den Primer und synthetisiert die benötigten Basen um die Lücken zu füllen b. kontrolliert ob es eventuelle Fehlpaarungen gibt. c. betreibt nick-translation, indem es den Einzelstrangbruch verschiebt

12. Was ist eine Genbibliothek und wie wird sie hergestellt? Je nach Art der Bibliothek die Ansammlung der möglichst gesamten genomischen DNA oder cDNA: a. genomische DNA-Bibliothek: Die gesamte zelluläre DNA eines Organismus wird durch Restriktionsenzyme in passende Fragmente zerlegt. Diese werden dann in einen geeigneten Klonierungsvektor eingefügt und vermehrt. => Repräsentation der genomischen DNA eines Organismus, in Millionen von DNA -Fragmenten b. cDNA-Bibliothek: Mithilfe reverser Transkriptase wird aus mRNA die komplementäre cDNA hergestellt. Diese wird dann in speziellen Klonierungsvektor (Expressionsvektor, meist Bakteriophagen) eingefügt und vermehrt. => Repräsentation des Transkriptioms eines bestimmten Gewebes, in Form vieler full -lenght-cDNA-Klone

13. Erklären Sie den Versuch von Griffith und Avery! a. Vorarbeit von Griffith: Er bewies, dass die Erbinformation auf einer stofflichen Basis beruht: i. Ablauf: Erreger => Strepptococcus pneumoniae (R-Zelle [ohne Schleimkapsel, nicht tötlich] & S-Zellen [Schleimkapsel, tötlich) ii. Er injizierte Maus A -> lebende R-Zellen, Maus B -> durch Hitze abgetötete S-Zellen (somit nicht lethal) und Maus C -> lebende R-Zellen + abgetötete S-Zellen 1) Maus A überlebte, Maus B überlebte, Maus C starb und man konnte lebende S-Zellen in ihr nachweisen. 2) Somit war es den R-Zellen, durch Transformation, die Information von den abgetöteten S-Zellen zu übernehmen! b. Vollendung durch Avery: Er bewies, dass die DNA der Träger der Erbinformation ist: i. In vier verschiedenen Behältern, welche alle mit lebenden R-Zellen und toten S-Zellen befüllt waren gaben sie folgendes hinzu: 1) Behälter 1: Amylase (polysaccharidspaltendes Enzym) 2) Behälter 2: Protease (proteinspaltendes Enzym) 3) Behälter 3: RNase (RNAspaltendes Enzym) 4) Behälter 4: DNase (DNAspaltendes Enzym) ii. Bei Behälter 1 - 3 kam es nach einiger Zeit zur Bildung von S-Zellen iii. Da es bei allen Behältern, bis auf den 4., zur Bildung von S-Zellen kam, muss die DNA, zumindest indirekt, für die Weitergabe nötige Information, verantwortlich sein.

14. Direkter Beweis, dass die DNA Träger der Erbinformation ist? a. Hershey-Chase-Experiment (In dem die DNA als transformierendes Agens identifiziert wurde) i. Man züchtete Bakteriophagen mit einer 35S (radioaktivem Schwefel) Proteinhülle und Bakteriophagen mit einer 32P (radioaktiver Phosphor) DNA, um sie zu markieren. ii. Dann gab man den markierten Phagenkulturen jeweils Bakterien (E. coli) hinzu. (Phagen injizierten ihre DNA) iii. Das Gemisch wurde nach kurzer Zeit im Mixer getrennt und danach zentrifugiert. 1) Dadurch trennten sich die (leeren) Proteinhüllen von den Bakterien, weder Bakterien noch Hüllen wurden dabei zerstört. 2) Bei der Zentrifugierung setzten sich die Bakterien im Sediment ab, während die leichten Bakterienhüllen im Überstand verblieben. iv. In den Schwefelproben konnte nur im Überstand Radioaktivität nachgewiesen werden. v. Bei den Phosphorproben konnte nur im Sediment Radioaktivität nagewiesen werden. vi. Somit war klar, die DNA wurde injiziert um das Bakterien zur Phagenproduktion anzuregen. Während die Proteinhülle außen verblieb. Somit muss die DNA die Erbinformation enthalten

15. Nenne Enzyme der Replikation und ihre Funktion? ○ Helikase - windet den Doppelstrang auf unter Lösung von W.Bbs, braucht ATP ○ Topoisomerase - Nehmen die Spannung bei der Aufwindung der DNA ○ DNA-Primase - definiert einen Starpunkt mit der Bildung eines RNA-Primers  RNA-Polymerase ○ DNA-Polymerase (-> Exonuklease-Aktivität)  Poly 1 - DNA-Reparatur (Entfernt zusammen mit RNasen die Primer)  Poly 2 - DNA-Reparatur, vor allem im Zuge der SOS-Antwort (Nach starken DNA-Schäden!)  Poly 3 - DNA-Replikation  Poly 4/Pol 5 - DNA-Reparatur, im Zuge der SOS-Antwort (Nach starken DNA-Schäden!) ○ DNA-Ligase  Sie bilden dabei eine Esterbindung zwischen einem Phosphatrest und dem Zucker Desoxyribose aus und verbinden somit die DNA-Stränge  Wichtig: □ lagging-strand: Beim zusammenkleben der Okazaki-Fragemente, nach die Primer herausgeschnitten wurden □ Reparatur: Verschiedene DNA-Reparatur-Mechanismen kleben per Ligase Strangbrüche □ Splicing: Beim Splicen auftretende Strangbrüche werden wieder geschlossen ○ Telomerase - per reverse Transkripttase-Aktivität verlängern diese den Leitstrang um einige Sequenzen, wodurch es der DNA Polymerase möglich ist nach erfolgten Priming den Folgestrang zu synthetisieren.

16. Transkriptionrsstart und -stopp bei Prokarya? a. START: Sigma-Faktor, bindet an die Pribnow-Box des Promotors und erhöht damit drastisch die Bindungswahrscheinlichkeit der Polymerase an dieser Stelle. Nun wird unter Einbau von Nukleotiden die Elongation gestartet, wobei der Sigma-Faktor abgespalten wird. b. STOPP: Unmittelbar nach den Stopp-Codon folgt der Terminator. Termination erfolgt dann intrinsisch (Haarnadelschleife) oder extrinsisch (Rho-Faktoren).

17. Translationsstart und -stopp bei Prokarya? a. START: Der Translationsvorgang beginnt, sobald eine Initiator -tRNA mit dem Start-Codon, das durch die 30S Untereinheit ausfindig gemacht wurde, eine Basenpaarung eingeht. b. STOPP: Sobald ein Stopcodon (UAA, UAG oder UGA) in die A-Stelle gelangt, kommt es zur Termination der Translation.

18. Replikation: Initiation bei Pro- und Eukarya? Prokaryoten: Synthese beginnt an einem Replikationsursprung (ori) [Bei E. coli, wird dieser oriC genannt]  oriC enthält 11 Kopien einer GATC-Sequenz □ diese Sequenzabfolge wird von einer speziellen Methylase erkannt und methyliert □ die Methylierung beider Stränge ist notwendig zur Initiation und ist nur alle 10 Minuten möglich  Und beheimatet auch die DnaA-Box, welche aus einigen repetitiven Basenabfolgen besteht □ dieser wird DnaA-Box genannt, da er vom Protein DnaA gebunden wird. Somit ist die Häufigkeit von der Menge an DnaA abhängig. □ die Bindung mit dem DnaA-Protein führt zu einer Krümmung der DNA und somit zu einer Denaturierung im Bereich der DnaA-Box.  Nach der Entwindung bindet die Helikase (DnaB) an und vergrößert den denaturierten Bereich und öffnet die Replikationsgabeln

Einf. i. d. Molekularbiologie Seite 2

□ und da die DNA verdrillt als supercoils vorliegt, muss diese für den weiteren Replikationsverlauf entwunden werden, die dabei entstehende Spannung wird von Topoisomerase vermindert.

Eukaryoten: Synthese beginnt an vielen 100 - 1000 Replikationsursprüngen und diese sind wesentlich schwieriger zu Identifizieren, nicht gleichmäßig über das Chromosom verteilt und findet nur während der S -Phase statt!  Bei der Bäckerhefe besteht der Ursprung aus ca. 100/200 Bps welche als ARS (autonomously replicating sequences) bezeichnet werden. □ An dieser Sequenz lagert sich der ORC-Komplex (origin of replication) an, welcher zu einer Denaturierung in diesem Bereich führt (ähnlich DnaA)  Nach der Entwindung bindet die Helikase (MCM) und vergrößert den denaturierten Bereich □ und da die DNA verwickelt vorliegt, muss diese für den weiteren Replikationsverlauf entwunden werden, die dabei entstehende Spannung wird von Topoisomerase vermindert. Diese laufen vor jeder Replikationsgabel mit.  Kontrolle der Initiation: □ Durch Zellzyklus regulierende Proteine wird eine korrekte und einmalige Replikation während der S-Phase garantiert. □ Unter Beteiligung von ORC zusammen mit Zellzyklusregulierende-Proteinen (Cdk)  Beim Übergang von G1 in S werden die Cdks (zellzyklusregulierende Kinasen) aktiviert  Entfernen der Cdc/Cdt1-Bremse aktiviert die Helikase □ Phosphorylierung des ORCs markiert diesen als bereit kopiert □ Wenn die DNA-Polymerase einmal von 5' nach 3' läuft ist sie kaum noch aufzuhalten, Kontrolle muss in der Initiation passieren

19. Monoklonale Antikörper: Herstellung, und Funktion? Eine B-Zelle (welche Antikörper bildet) wird mit einer Tumorzelle fusioniert. Die daraus resultierende Hybridzelle kann sich unbegrenzt teilen und sezerniert nun Antikörper eines einzigen (monoklonalen) Typs. => monoklonale Antikörper erkennen sehr spezifisch Antigene mit ihren Antigenbindungsstellen. Somit bilden sie mit dem gesuchten Molekül ein Aggregat. => somit sind die im Gegensatz zu polyklonalen AK (welche weniger spezifisch sind) besonders für die Wissenschaft geeignet!

20. Anwendungen von monoklonalen Antikörpern Molekülmarker (durch Kopplung mit einer Fluoreszenzfarbstoffes oder kolloidale Goldpartikel, Assay ELISA), Erkennung von Proteinen (Western Blotting), Aufreinigung von Molekülen

21. Irgendwas mit Wurzelhalsgallen und warum das Agrobakterium irgendwas induziert; Die Beobachtung, dass gewisse Bodenbakterien wie Agrobacterium tumefaciens bei Pflanzen Tumorwachstum hervorruft, in dem es ein Plasmid mit Ti-DNA in die Pflanze einbringt, und diese Pflanze dann die T-DNA in ihr Genom einbaut, gab einen Schlüssel zur genetischen Veränderungen von Pflanzen. Ti-Plasmid kann nicht in E.Coli vermehrt werden. Auf dem Ti-DNA-Plasmid befindet sich ein Gen, das Nopalin codiert, ein Pflanzenwachstumshormon. Dieses Gen kann man nun durch andere Gene ersetzen, und somit die Pflanzen gezielt verändern. Und zum beschleunigten Wachstum führen.

22. 5 Gegenstrategien von Kulturpflanzen • Vermeidung von Wunden (Schutz vor Frost, Nematoden, bohrenden Insekten) • Fruchtfolge (Abnahme Agrobacterium-Konzentration) • Bacterizide (Kupferbasis, funktioniert nur wenn vor Infektion) • Ausbringung avirulenter Stämme (in Kombination mit Bakteriziden) • Wein: Heißwasserbehandlung vor Austrieb • Entwicklung resistenter Sorten

23. Nicht-kovalente Bindungen zwischen Proteinen? a. b. c. d.

Wasserstoff-Brückenbindungen Ionenbindungen Apolare Bindungen Van-der-Waals-Kräfte

24. Versuch von Beadle und Tatum zur "Ein-Gen-ein-Enzym"-Hypothese? Sie setzten Brotschimmel Röntgenbestrahlungen aus und erzeugten dadurch Mutationen. Eine Reihe von Experimenten zeigte, dass durch diese Mutationen Veränderungen spezifischer Enzyme hervorgerufen wurden. Diese Experimente führte zu der Vermutung, dass ein direkter Zusammenhang zwischen Genen und enzymatischen Reaktionen vorliegt. Diese Hypothese wird auch als Ein-Gen-ein-Enzym-Hypothese bezeichnet. Durch das Entdecken von Strukturproteinen und dem alternativen Spleißen muss diese Hypothese jedoch abgewandelt werden. Somit codiert ein Gen eine biologisch aktive RNA, diese wird aber nicht zwangsläufig als Polypeptid translatiert. (z.B. Ribozym)

25. 3 Gründe warum die Ein-Gen-ein-Enzym Hypothese nicht haltbar ist? s.o a. Ein Gen codiert zwar eine biologisch aktive RNA, jedoch muss diese nicht als Polypeptid translatiert werden (z.B. Ribozym) b. Ein DNA-Abschnitt codiert auch nicht katalytische Proteine (z.B. Strukturproteine) c. Durch das alternative Spleißen bei Eukaryoten entstehen aus einem DNA-Abschnitt unterschiedliche mRNAs, welche unterschiedliche Proteine kodieren.

26. Wie kann man Protein-Protein-Interaktionen nachweisen? GFP (grünes Fluoreszenzprotein) ermögli...