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Protokoll zum Praktikum im Modul Molekulare Biologie II zum Thema Photosynthese: Hill-Reaktion....

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20.02.2018

VERSUCH 4 Photosynthese: Hill-Reaktion

Kurs C Betreuerin: Hsin-Chien Protokollanten:

1. Einleitung Dieser Versuch beschäftigt sich mit den Redoxvorgängen und Elektronenflüssen im Photosyntheseapparat von Cyanobakterien unter Nutzung von DCPIP als künstlichem Elektronendonator bzw. -akzeptor. Des Weiteren soll die Wirkung des Photosynthese-Hemmstoffs DCMU untersucht werden. Dazu muss zuerst eine Extinktions-Eichgerade für DCPIP(ox) erstellt werden. Mit deren Hilfe wird danach die Aktivität der Bakteriensuspension unter verschiedenen Lichtbedingungen und unter Einwirkung von DCMU photometrisch bestimmt.

2. Material und Methoden Versuchsdurchführung nach Skript, keine Änderungen.

2.1 Versuchsobjekt Synechococcus sp. (Cyanobakterium)

2.2 Laborbedingungen Standartlaborbedingungen, RT

3. Ergebnisse Tabelle 1: Gemessene Extinktion der DCPIPox-Verdünnungsreihen und berechnete DCPIPox-Konzentrationen zum Erstellen einer Eichgeraden. 2mM DCPIPox DCPIPox Konzentration in in µl mM 20 0,02 40 0,04 80 0,08 120 0,12 160 0,16

1

2

0,082 0,165 0,333 0,489 0,652

3

0,08 0,162 0,328 0,482 0,647

Mittelwert Standardabweichung

0,08 0,165 0,331 0,487 0,652

0,081 0,164 0,331 0,486 0,650

0,00115 0,00173 0,00252 0,00361 0,00289

Berechnung der eingesetzten DCPIPox-Konzentration: 𝑐1 ∗ 𝑉1 = 𝑐2 ∗ 𝑉2 mit c1 = DCPIPox-Stammlösung-Konzentration (2mM), V1 = pipettiertes Volumen 2mM DCPIPox, c2 = DCPIPox-Konzentration (gesucht), V2 = Gesamtvolumen (2ml). 𝑐2 =

𝑐1 ∗𝑉1 𝑉2

= DCPIPox-Konzentration in mM

Beispiel: 𝑐2 =

2𝑚𝑀 ∗ 20µ𝑙 2𝑚𝑙

= 0,02 𝑚𝑀

Mittelwert und Standardabweichung wurden gemäß Kursskript S.61 Gleichung 1 (Mittelwert) und Gleichung 2 (Varianz) berechnet. Dabei ist die Standardabweichung die Quadratwurzel der Varianz.

Eichgerade 0,7 0,6

OD590

0,5 0,4 0,3 0,2

y = 4,0702x

0,1 0,0 0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

0,16

0,18

DCPIPox-Konzentration [mM]

Abbildung 1: Eichgerade aus den Mittelwerten der Absorption bei 590nm aufgetragen gegen die eingesetzten DCPIPox-Konzentration. Blaue Kreuze markieren die Mittelwerte, die Standardabweichung ist als orangener Fehlerbalken beim jeweiligen Mittelwert eingetragen. Der x-Wert der Eichgeradengleichung entspricht der DCPIPox-Konzentration in mM und der y-Wert der optischen Dichte bei 590nm.

Tabelle 2: Verlauf der Extinktionsänderung im Ansatz C zum Bestimmen der Cyanobakteriensuspension (OD590 gegen Referenzansatz A gemessen).

Zeit in min Ansatz C-1

2 0,558

4 0,504

6 0,466

8 0,425

10 0,384

12 0,342

14 0,301

16 0,259

18 0,238

Die Extinktion nahm (wie erwartet) nicht zu schnell ab, weshalb die für Ansatz C-1 verwendete 1:20 Verdünnung im anschließenden Hauptversuch benutzt wurde. Tabelle 3: Messwerte der Ansätze B-G (OD590) im zeitlichen Verlauf (0-24min).

Zeit in min B 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

C 0,511 0,456 0,433 0,422 0,413 0,387 0,384 0,381 0,369 0,333 0,332 0,330 0,331

0,524 0,463 0,376 0,319 0,221 0,183 0,131 0,095 0,073 0,056 0,028 0,029 0,023

Ansatz D E 0,539 0,508 0,490 0,446 0,409 0,411 0,360 0,322 0,327 0,299 0,263 0,254 0,231

F 0,574 0,475 0,406 0,315 0,242 0,219 0,206 0,187 0,205 0,201 0,178 0,178 0,173

G 0,545 0,477 0,49 0,318 0,245 0,187 0,185 0,193 0,172 0,170 0,163 0,185 0,183

0,444 0,322 0,281 0,220 0,184 0,141 0,126 0,129 0,126 0,127 0,129 0,125 0,118

Berechnung der DCPIPox-Konzentrationen in den Ansätzen B-G: Gleichung der Eichgeraden: 𝑦 = 4,0702𝑥 mit x = DCPIPox-Konzentration und y = OD590. 𝑂𝐷590 𝑂𝐷590 Berechnung der Konzentration: 𝑐 = = 𝑖𝑛 𝑚𝑀 𝑚 4,0702

Beispiel: 𝑐 =

0,511 4,0702

= 0,1255 𝑚𝑀

Tabelle 4: DCPIPox-Konzentrationen (in mM) in den Ansätzen B-G im zeitlichen Verlauf (0-24min).

Zeit in min B 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

C 0,1255 0,1120 0,1064 0,1037 0,1015 0,0951 0,0943 0,0936 0,0907 0,0818 0,0816 0,0811 0,0813

0,1287 0,1138 0,0924 0,0784 0,0543 0,0450 0,0322 0,0233 0,0179 0,0138 0,0069 0,0071 0,0057

Ansatz D E 0,1324 0,1248 0,1204 0,1096 0,1005 0,1010 0,0884 0,0791 0,0803 0,0735 0,0646 0,0624 0,0568

F 0,1410 0,1167 0,0997 0,0774 0,0595 0,0538 0,0506 0,0459 0,0504 0,0494 0,0437 0,0437 0,0425

G 0,1339 0,1172 0,1204 0,0781 0,0602 0,0459 0,0455 0,0474 0,0423 0,0418 0,0400 0,0455 0,0450

0,1091 0,0791 0,0690 0,0541 0,0452 0,0346 0,0310 0,0317 0,0310 0,0312 0,0317 0,0307 0,0290

20 0,202

DCPIPox-Konzentration gegen die Zeit

DCPIPox-Konzentration in mM

0,14 0,12 0,10 0,08 0,06 0,04 e1(x) = -0,009x + 0,1364 0,02

f1(x) = -0,0093x + 0,1393 g1(x) = -0,007x + 0,1001

0,00 0,00

f2(x) = -0,0001x + 0,0464

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

Zeit in min B

C

D

E

F

G

E1

F1

G1

F2

Linear (B)

Linear (C)

Linear (D)

Linear (E)

Linear (F)

Linear (G)

Linear (E1)

Linear (F1)

Linear (G1)

Linear (F2)

Abbildung 2: Zeitlicher Verlauf der molaren DCPIPox-Konzentration in den Ansätzen B-G. Zusätzlich wurden die Abschnitte 1-10min der Ansätze E, F und G, sowie der Abschnitt 11-24min des Ansatzes F eingezeichnet, inklusive Eichgeraden. Die Ableitung (bzw. die Steigung) der Gleichung der Ausgleichsgerade beschreibt die Änderung der molaren DCPIPox-Konzentration pro Minute: B: 𝑏(𝑥) = −0,0017𝑥 + 0,116 ; 𝑏‘(𝑥) = −0,0017 C: 𝑐(𝑥) = −0,0052𝑥 + 0,1103 ; 𝑐‘(𝑥) = −0,0052 D: 𝑑(𝑥) = −0,0032𝑥 + 0,1301 ; 𝑑‘(𝑥) = −0,0032 E: 𝑒(𝑥) = −0,0035𝑥 + 0,1098 ; 𝑒‘(𝑥) = −0,0035 F: 𝑓(𝑥) = −0,0037𝑥 + 0,1111 ; 𝑓‘(𝑥) = −0,0037 G: 𝑔(𝑥) = −0,0027𝑥 + 0,0788 ; 𝑔‘(𝑥) = −0,0027 E1: 𝑒1(𝑥) = −0,009𝑥 + 0,1364 ; 𝑒1′ (𝑥) = −0,009 F1: 𝑓1(𝑥) = −0,0093𝑥 + 0,1393 ; 𝑓1′(𝑥) = −0,0093 F2: 𝑓2(𝑥) = −0,0001𝑥 + 0,0464 ; 𝑓2′ (𝑥) = −0,0001 G1: 𝑔1(𝑥) = −0,007𝑥 + 0,1001 ; 𝑔1′ (𝑥) = −0,007 Der Bereich 0-24 min des Ansatzes C und die Bereiche 0-10 min der Ansätze E, F und G geben Auskunft über den Elektronenfluss in Photosystem II (PSII). Der Bereich 11-24 min des Ansatzes F gibt Auskunft über den Elektronenfluss in Photosystem I (PSI). Somit kann die Aktivität der beiden Photosysteme bestimmt werden, indem man für PSII die Änderung der molaren Konzentration von DCPIPox pro Minute des Ansatzes B von dem Mittelwert der Änderungen der molaren Konzentration von DCPIPox pro Minute der oben genannten Bereiche und Ansätze substrahiert: | −0,0017| = 𝟎, 𝟎𝟎𝟓𝟗

𝑐 ′ (𝑥) + 𝑒1′ (𝑥 ) + 𝑓1′ (𝑥) + 𝑔1′ (𝑥) 4

− 𝑏′(𝑥)| = |

−0,0052−0,009−0,0093−0,007 4

−

Für PSI subtrahiert man die Änderung der molaren Konzentration von DCPIPox pro Minute des Ansatzes B von der Änderung der molaren Konzentration von DCPIPox pro Minute des oben genannten Bereichs: | 𝑓2′(𝑥) − 𝑏 ′ (𝑥)| = |0,0001 − 0,0017| = 𝟎, 𝟎𝟎𝟏𝟔 Damit kann man die Aktivität beider Photosysteme vergleichen: PSII/PSI = 0,0059/0,0016 = 3,7031 Tabelle 5: Übersicht über den Elektronenfluss in den Ansätzen B-G sowie des jeweiligen Elektronendonors und -akzeptors.

Ansatz

Elektronen -donor -akzeptor

Bemerkung

B

H2O

DCPIPox

Dunkelreaktion, leichte Abnahme der OD

C

H2O

DCPIPox

D E

H2O

-

Beleuchtet, kontinuierliche OD-Abnahme DCMU hemmt Elektronenübertragung vom PSII auf Primärakzeptor

-

Beleuchtet, kontinuierliche OD-Abnahme DCMU hemmt Elektronenübertragung vom PSII auf Primärakzeptor

min 1-10 min 11-24 F min 1-10

H2O

DCPIPox

DCPIPred H2O

DCPIPox

min 11-24 G

DCPIPred

Beleuchtet, kontinuierliche OD-Abnahme Messung der Aktivität von PSI (ODMethylviologen Zunahme)

min 1-10 min 11-24

H2O DCPIPred

DCPIPox Beleuchtet, kontinuierliche OD-Abnahme Methylviologen Unbeleuchtet, OD stagniert fast

4. Diskussion Ansatz B: Ansatz B wurde dauerhaft im Dunklen gehalten. So kommt es auch nicht zu einer Hydrolyse des Wassers und DCPIP kann keine Elektronen aufnehmen. Allerdings ist trotzdem ein leichter Abfall der DCPIPox-Konzentration erkennbar (Tabelle 4/Abbildung 2). Dies liegt einerseits daran, dass der Ansatz beim Messen immer wieder geringfügig Licht ausgesetzt wurde. Andererseits besitzen Cyanobakterien die Besonderheit, dass sowohl oxygene Photosynthese als auch aerobe Respiration in einer Zelle stattfindet. Durch die respiratorische Elektronentransportkette können geringfügig weitere Elektronen generiert werden, wodurch DCPIPox zu DCPIPLeu reduziert wird. Es kommt zu einem leichten Abfall der DCPIPox-Konzentration (Tabelle 4/Abbildung 2). Ansatz C: Ansatz C wurde dauerhaft von Licht bestrahlt, wodurch es zur Hydrolyse des Wassers am Photosystem II kommt. Die erzeugten Elektronen werden von der Hill-Reagenz DCPIPox aufgenommen, wodurch DCPIPox zu DCPIPLeu reduziert wird. Dies macht sich im starken Abfall der DCPIPox- Konzentration bemerkbar (Tabelle 4/Abbildung 2). Ansatz D: Ansatz D wurde dauerhaft von Licht bestrahlt. Allerdings wurde kein zusätzliches Wasser hinzugefügt, stattdessen aber ab Beginn DCMU. DCMU verhindert, dass Elektronen vom Photosystem II auf den Akzeptor übertragen werden. Dennoch steht Wasser als Elektronendonor zur Verfügung, da dies auch im Phosphatpuffer enthalten ist. Da wir trotz des DCMU einen DCPIPox Konzentrations-Abfall haben (Tabelle 4/Abbildung 2), könnte man vermuten, dass DCMU nicht vollständig gewirkt hat und einige Elektronen von DCPIPox aufgenommen wurden. Ansatz E: Ansatz E wurde dauerhaft mit Licht bestrahlt. Bis zu Minute 10 haben wir einen ähnlichen Verlauf der DCPIPox Konzentration wie im Ansatz C (Tabelle 4/Abbildung 2), auch wenn diese, eventuell aufgrund der geringeren Wassermenge, etwas geringer abfällt. Nach 10 Minuten wurde DCMU hinzugegeben (Wirkung DCMU siehe Ansatz D). Die Konzentration sollte durch die Blockade des Elektronentransports nun in etwa konstant bleiben. Dies ist auch weites gehend der Fall (Tabelle 4/Abbildung 2). Ein geringer Abfall liegt zwar vor, dieser ist aber auch hier möglicherweise auf die nicht vollständige Wirkung des DCMU zurückzuführen. Ansatz F: Auch Ansatz F wurde dauerhaft mit Licht bestrahlt. Bis zur Minute C nimmt die DCPIPox Konzentration ähnlich ab wie bei Ansatz C (Tabelle 4/Abbildung 2). Nach 10 Minuten werden sowohl DCMU, als auch Methyviologen. Die Konzentration von DCPIPox schwankt nachfolgend leicht, bleibt aber in ihrem Trend konstant (Tabelle 4/Abbildung 2). Dass die Konzentration nicht weiter abfällt, liegt am DCMU, welches den Elektronentransport blockiert. Der leichte Anstieg dagegen ist durch das Methylviologen zu erklären (Tabelle 4/Abbildung 2). Methylviologen dient als Elektronenakzeptor (Hill-Reagenz). Es kann dem Photosystem I also ein Elektron entnehmen. Da in den ersten 10 Minuten bereits einige DCPIPox zu DCPIPLeu reduziert wurden, kann DCPIPLeu durch seine reversible Elektronenaufnahme, nun wieder einige Elektronen abgeben, welches von PS I aufgenommen wird um seine Elektronenlücke zu füllen. Als Folge haben entsteht wieder DCPIPox und dessen Konzentration steigt (Tabelle 4/Abbildung 2). DCMU kann diesesProzess auch nicht blockieren, da es am PS II wirkt und kein zwischengeschalteten Prozess vor PS I blockieren kann.

Ansatz G: Ansatz G wurde genauso wie Ansatz F behandelt, nur das dieser nach der Hinzugabe von DCMU und Methylviologen ins Dunkle gestellt wurde. Bis zur Minute 10 haben wir demnach auch hier einen ähnlichen Verlauf wie im Ansatz C (Tabelle 4/Abbildung 2). Anschließend ist wie im Ansatz F ein leichtes Auf und Ab zu erkennen (Tabelle 4/Abbildung 2). Auch die Begründung dafür ist die gleiche wie bei F. Das wird den Ansatz anschließend ins dunkle gestellt haben ist im Grunde irrelevant, da DCMU sowieso die Weitergabe des Elektrons von Photosystem II verhindert hätte....