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Protokoll zum Versuch ADH im Sommersemester Jahr 2019 von Proteinchemischen Grundpraktikum...

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Proteinchemisches Grundpraktikum SS 19 Protokoll zu Versuch: 1 Titel: ADH: Der enzymatisch-optische Test – AlkoholdehydrogenaseReaktion Praktikant/in: Gaukhar Sagindykova

Praktikumsnummer: 339

Praktikant/in: Greta Fugazza

Praktikumsnummer: 340

Versuch durchgeführt am: 19.06.2019 Versuchsbetreuung: Martina Just

Kolloquium: Corinna Sommer

Datum: 30.06.2018

Wir versichern, dass wir dieses Protokoll komplett eigenständig angefertigt haben: Unterschriften: ........................................ ........................................

Kommentar zum Protokoll:

Datum: ....................... Bewertung:

Unterschrift: .................................................................... 1

Einleitung Die in den Stoffwechselwegen der Organismen stattfindenden Reaktionen sind häufig von Enzymen katalysiert. Enzyme sind Proteine, die mit dem Substrat interagieren und mit Coenzymen kooperieren, um die Aktivierungsenergie der Reaktion herabzusetzten und somit die Reaktion zu beschleunigen. Dabei besitzen Enzyme meistens eine sehr hohe Spezifizität gegenüber ihrem Substrat und der Reaktion, die sie katalysieren, weshalb man in Anwesenheit eines Gemisches von Stoffen, selbst wenn man genau ein Substrat untersuchen will, das Trennen der einzelnen vermeiden kann. Zur Bestimmung eines Substrates kann man sich im Labor zudem die oben genannten Coenzyme zu Nutze machen, die im Laufe der Reaktion nicht unverändert bleiben und in stöchiometrischen Verhältnissen zum umgesetzten Substrat auftreten. Bei der im Versuch untersuchten Alkoholdehydrogenasereaktion handelt es sich um eine Redoxreaktion. Das Enzym Alkoholdehydrogenase katalysiert dabei die Reaktion und die Rückreaktion von Ethanol unter Anwesenheit des Coenzyms Nicotidamid-Adenin-Dinucleotid (NAD+) als Elektronenübertrager zu Ethanal und NADH + H+. Die Bestimmung des Substrats kann dadurch auch anhand des enzymatisch-optischen Test photometrisch erzielt werden und bezieht sich auf den verschiedenen Absorptionen der Coenzyme vor und nach der Umsetzung. Das Gleichgewicht der Reaktion wird dabei vom Enzym nicht verändert. Die Gleichgewichtskonstante bleibt somit, falls nicht von äußeren Einflüssen wie Temperatur - und Druckveränderungen gestört, konstant und lässt sich mittels des Massenwirkungsgesetz einfach ausrechnen. Unter physiologischen Bedingungen liegt das Gleichgewicht jedoch stark auf Seiten des Ethanols, was für seine Bestimmung ungünstig ist. Deshalb wird die ADH Reaktion mit einer im Stoffwechselweg ihr vorgestellten Reaktion gekoppelt, die nicht von einem Enzym abhängig ist. Ethanal reagiert dabei zum Semicarbazon weiter und wird somit dem Gleichgewicht entzogen, was dazu führt, dass die Reaktion vollständig ablaufen kann und das gesamte Ethanol in Ethanal umgewandelt wird. Diese analytische Untersuchung nennt man Endwertmethode, die anhand des Lambert-Beer´schen-Gesetzes ausgewertet werden kann. Auch wenn die Alkoholdehydrogenase zur Enzymklasse der Dehydrogenasen gehört, besitzt sie nicht eine so hohe Substratspezifität wie andere Dehydrogenasen. Die aus der Hefe gewonnene ADH hat diese Spezifität nämlich nur in Bezug auf das Coenzym bzw. Cosubstrat NAD+/NADH und das Substratsystem Ethanol/Ethanal entwickelt. Somit kann sie, auch wenn in geringerem Maße, zusätzlich zum oben genannten Substratsystem auch andere Substrate umsetzen. Der Grund hierfür liegt in der räumlichen Struktur des Substratmoleküls und ist das Phänomen der Prochiralität. In folgenden Versuch soll somit die ADH Reaktion samt ihres Enzyms ADH untersucht werden. Dazu bedient man sich der Coenzyme NAD/NADH, von denen zunächst das Spektrum aufgenommen werden muss. Folglich wird im nicht-Sättigungsbereich die Konzentration der Reaktanten anhand der Endwertmethode untersucht und die Gleichgewichtskonstante der Reaktion ermittelt. Im letzten Versuchsteil soll die in der Theorie wahrgenommene Spezifität der ADH überprüft werden.

2

Durchführung 4.1. Aufnahme der Absorptionsspektren von NAD+ und NADH Im ersten Teilversuch sollte das Absorptionsspektrum von einer Lösung gemessen werden. Dafür wurde zu Beginn ein Referenzspektrum (von 240 nm bis 360 nm) aufgenommen. Die dafür nötige Lösung wurde wie folgt hergestellt Tabelle 1. Pipettierschema für die Aufnahme des Referenzspektrums des NAD+/NADH

Na-Disphosphatpuffer pH=8,8/Semicarbazid (mM) Absolutes Ethanol (%), (mM)

48,75 2,5

Für die Aufnahme des Absorptionsspektrums von NAD+ und NADH, wurden die verschiedenen Komponenten der ADH Reaktion in die Probelösung bis auf das Enzym Alkoholdehydrogenase (ADH) pipettiert. Nach Zugabe der ADH sollte die Küvette mit der Lösung sofort ins Photometer gegeben werden, weil das Enzym den Start der Umsetzung von NAD+ zu NADH bewirkte. Die Reaktion sollte für 15 Minuten zwischen 240 nm und 360 nm beobachtet werden. Die Messung des Spektrums des NADH erfolgte auf gleicher Weise. Tabelle 2. Pipettierschema zur Messung des Absorbtionsspektrums von NAD+ und NADH

Na-Disphosphatpuffer pH=8,8/Semicarbazid (mM) NAD+ (mM) Absolutes Ethanol (%) (mM) Hefe-ADH-Lösung (500 U/ml) (µl)

47,38 124,69 10,025 5

4.2. Endpunkt-Bestimmung unbekannter NAD+ und Ethanol-Konzentration Die Bestimmung der unbekannten NAD+ Konzentration und Ethanol-Konzentration erfolgte photometrisch bei der Wellenlänge von 339 nm. Dafür wurden die Testlösungen wie folgt zusammengesetzt Tabelle 3. Pipettierschema für die Bestimmung der Konzentration einer unbekannten Ethanol-Lösung

NaDiphosphatpuffer pH=8,8 (mM) NAD+ Lösung (mM) Ethanol-Lösung (%) unbekannte Ethanol Lösung (%) dest. Wasser (µl)

Referenz Küvette 1 37

Kalibrierungswerte Küvette 2,3 Küvette 4,5 37 37

Unbekannte Ethanol-Lösung Küvette 6,7 Küvette 8,9 37 37

0,5 0,125 -

0,125 -

0,0625 -

2

1

350

300

325

300

325 3

Hefe-ADH (500 U/ml) (µl)

-

50

50

50

50

Tabelle 4. Pipettierschema für die Bestimmung der Konzentration einer unbekannten NAD+ Lösung

NaDiphosphatpuffer pH=8,8 (mM) NAD+ Lösung (mM) Ethanol-Lösung (%) unbekannte Ethanol Lösung (%) dest. Wasser (µl) Hefe-ADH (500 U/ml) (µl)

Referenz Küvette 1 37

Kalibrierungswerte Küvette 2,3 Küvette 4,5 37 37

Unbekannte NAD+ -Lösung Küvette 6,7 Küvette 8,9 37 37

0,1 2

0,1 2

0,05 2

2 2

1 2

550 -

500 50

525 50

500 50

525 50

Die erste Lösung wurde jeweils als Referenzprobe verwendet, um den Nullabgleich für die restlichen Proben durchzuführen. Damit man eine Kontrolle über die Menge der umgesetzten Stoffe in den Proben unbestimmter Konzentration hatte, wurden in den Proben 2-5 Lösungen mit bekannter Substrat-und Cosubstratkonzentration hergestellt. Diese Werte dienten dann als Kalibrierungswerte. Für die Bestimmung der unbekannten Ethanolkonzentration mussten die Proben 90 Minuten bei … °C in einem Wasserbad inkubieren, wobei die Proben für die NAD+ Bestimmung nur 15 Minuten inkubieren mussten. Nach der Inkubationszeit wurden die Proben in 1 cm dicke Einmalküvetten aus Kunststoff pipettiert und folglich photometrisch gemessen. Damit die Inkubationszeit für alle Proben gleich lang war, wurden alle Komponenten bis auf das Enzym vorpipettiert und das Enzym folglich in 30 s Abständen in den verschiedenen Proben dazugegeben.

4.3. Bestimmung der Gleichgewichtskonstanten für die ADH-Reaktion In diesem Teilversuch sollte die Gleichgewichtskonstante der Alkoholdehydrogenase-Reaktion bestimmt werden. Dazu wurden 9 Proben nach folgendem Pipettierschema hergestellt, wobei die erste wiederum als Nullabgleich für die anderen 8 diente. Tabelle 5. Pipettierschema zur Bestimmung der Gleichgewichtskonstanten der ADH-Reaktion

NaDisphosphatpuffer, pH=9,8 (mM) NaDisphosphatpuffer, pH= 8,8 (mM) NAD+ Lösung (mM) Ethanol-Lösung (mM)

Küvette 1 -

Küvette 2,3 -

Küvette 4,5 45

Küvette 6,7 -

Küvette 8,9 -

46

45

-

43

43

0,2 0,25

0,2 0,25

0,2 0,25

0,2 0,5

0,4 0,25

4

ADH-Lösung (500 U/ml) (µl)

-

50

50

50

50

Alle Probelösungen wurden 15 Minuten lang inkubiert, wobei daraufhin ihre Extinktion bei 339 nm anhand des Spektralphotometers gemessen wurde.

4.4. Bestimmung der relativen spezifischen Aktivität von ADH gegenüber verschiedenen Alkoholen Zu Beginn sollte eine 1:10 verdünnte ADH Lösung mit einer Aktivität von 50 U/ml hergestellt werden. Dafür wurden 10 µl ADH-Stammlösung (500 U/ml) mit 90 µl bidestilliertem Wasser versetzt. Diese wurden durch auf-und abpipettieren gut vermischt. Zur Bestimmung der relativen spezifischen Aktivität vom Enzym ADH gegenüber verschiedenen Alkoholen, wurden 4 Proben in Kunststoffküvetten folgendermaßen pipettiert Tabelle 6. Pipettierschema zur Bestimmung der relativen Spezifität des Enzyms ADH

NaDiphosphatpuffer, pH= 8,8 (mM) NAD+ Lösung (mM) absolutes Ethanol (%) absolutes Ethanol (%) absolutes Propanol (%) absolutes Butanol (%) Dest. Wasser ADH-Lösung (µl)

Küvette 1 37

Küvette 2 37

Küvette 3 37

Küvette 4 37

0,2

0,2

0,2

0,2

2

-

-

-

-

2

-

-

-

-

2

-

-

-

-

2

500 5

500 5

500 5

500 5

Auch hier sollte die ADH erst dann zugegeben werden, wenn man bereit war zu messen. Durch Zugabe der ADH startete nämlich auch die ADH-Reaktion. Sobald die ADH dazugegeben wurde, wurde die Küvette in das auf 399 nm eingestellte Photometer gestellt und der Leerwert gemessen („Set Ref“ drücken). Nach 2 Minuten wurde die Extinktion notiert.

5

Ergebnisse 3.1 Absorptionsspektren von NAD+ und NADH Die Messung ergab folgende Ergebnisse:

Abbildung 1. Photometrische Messung des Absoptionsspektrums des NAD+ im Bereich 240-360 nm

Abbildung 2. Photometrische Messung des Absorptionsspektrums des NADH im Bereich 240-360 nm

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Von der Abb. 1 und 2 lassen sich maximale Extinktionswerte der NAD+ und NADH erkennen. Während NAD+ nur ein Absorptionsmaximum von 1,94 bei 259 nm besitzt, zeigt NADH zwei Absorptionsmaxima, 1,68 bei 259 nm und 0,64 bei 340 nm. Durch die gemessenen Absorptionsmaxima sind die Extinktionskoeffizienten zu berechnen. Erstens muss man aber die Konzentrationen von NAD+ und NADH folgendermaßen ermitteln: 5 𝑐𝐴𝑛𝑓𝑎𝑛𝑔 ∙ 𝑉𝑒𝑖𝑛𝑔𝑒𝑠𝑒𝑡𝑧𝑡 = 𝑐NAD+ = 𝑉𝑔𝑒𝑠𝑎𝑚𝑡

𝑚𝑚𝑜𝑙 −3 𝐿 ∙ 0,05 ∙ 10 𝐿 = 0,125 ∙ 10−3 𝑚𝑜𝑙 2 ∙ 10−3 𝐿 𝐿

5 𝑐𝐴𝑛𝑓𝑎𝑛𝑔 ∙ 𝑉𝑒𝑖𝑛𝑔𝑒𝑠𝑒𝑡𝑧𝑡 = 𝑐NADH = 𝑉𝑔𝑒𝑠𝑎𝑚𝑡

𝑚𝑚𝑜𝑙 −3 𝐿 ∙ 0,05 ∙ 10 𝐿 = 0,122 ∙ 10−3 𝑚𝑜𝑙 2,05 ∙ 10−3𝐿 𝐿

Mittels des Lambert-Beer´schen-Gesetzes lässt sich der Extinktionskoeffizient berechnen: 𝐸 = 𝜀⋅𝑑⋅𝑐 𝜀=

𝐸 𝑑⋅𝑐

E – Extinktion d – Schichtdicke der Küvette, cm c – Konzentration der Lösung, mol*L 𝜀 – Extinktionskoeffizient, L*cm-1*mol-1 𝜀𝑁𝐴𝐷+ =

1,94 1 𝑐𝑚 ∙ 0,125 ∙ 10−3 1,68

𝜀𝑁𝐴𝐷𝐻/259𝑛𝑚 =

𝑚𝑜𝑙 𝐿

= 15,52 ∙ 103

𝑚𝑜𝑙 1 𝑐𝑚 ∙ 0,122 ∙ 10−3 𝐿

𝜀𝑁𝐴𝐷𝐻/340𝑛𝑚 =

0,64 1 𝑐𝑚 ∙ 0,122 ∙ 10−3

𝑚𝑜𝑙 𝐿

𝑐𝑚 ∙ 𝐿 𝑚𝑜𝑙

= 13,77 ∙ 103 = 5,25 ∙ 103

𝑐𝑚 ∙ 𝐿 𝑚𝑜𝑙

𝑐𝑚 ∙ 𝐿 𝑚𝑜𝑙

3.2 Endpunkt-Bestimmung unbekannter NAD+-Konzentrationen Die Werte in der Tab. 7 und 8 wurden auf folgender Weise berechnet: 1. Mittelwert der Extinktion:

 = 1 ∑ 2𝑖=1 𝐸𝑖 = 𝐸1+𝐸2 𝛥𝐸 2 2

0,357+0,340 𝛥𝐸 +𝛥𝐸 = 0,3495 Beispiel (EtOH-Bestimmung, Küv. 4,5): 𝛥𝐸1 = 2 2 3 = 2

2. Eingesetzte Konzentrationen der Lösungen (cBer):

7

Durch die komplette Umsetzung von NAD+ zu NADH mittels Semicarbazid, steht die NAD+Konzentration direkt mit NADH- bzw Ethanol-Konzentration direkt in Verbindung. Dadurch lässt sich die cBer berechnen: 𝑐𝑏𝑒𝑟 = Beispiel (EtOH-Bestimmung, Küv. 2,3):

𝑐𝐴𝑛𝑓𝑎𝑛𝑔 ∙ 𝑉𝑒𝑖𝑛𝑔𝑒𝑠𝑒𝑡𝑧𝑡 𝑉𝑔𝑒𝑠𝑎𝑚𝑡 𝑐𝑏𝑒𝑟 =

6,25𝑚𝑀∙0,05𝑚𝐿 2,5𝑚𝐿

= 0,125𝑚𝑀

3. Zur Bestimmung der cspektr benötigt man das Lambert-Beer´sche Gesetz (siehe 3.1). Es folgt also: 𝑐𝑠𝑝𝑒𝑘𝑡𝑟 = Beispiel (EtOH-Bestimmung, Küv. 2,3): 𝑐𝑠𝑝𝑒𝑘𝑡𝑟 =

𝛥𝐸 𝑑∙𝜀 0,415

1 𝑐𝑚 ∙ 6,2∙103

𝐿 𝑚𝑜𝑙∙𝑐𝑚

= 9,74 ∙ 10−5 𝑀

4. Berechnung der unbekannten Ethanol-Konzentration: 𝑐𝑏𝑒𝑟(2,3) 𝑐𝑢𝑛𝑏(6,7) = 𝑐𝑠𝑝𝑒𝑘𝑟(6,7) 𝑐𝑠𝑝𝑒𝑘𝑡𝑟(2,3) Beispiel (EtOH-Bestimmung, Küv. 6,7): 𝑐𝑏𝑒𝑟(2,3) ∙ 𝑐𝑠𝑝𝑒𝑘𝑡𝑟(6,7) 1,25 ∙ 10−4 𝑀 ∙ 7,68 ∙ 10−5 𝑀 = = 1,43 ∙ 10−4 𝑀 𝑐𝑢𝑛𝑏(6,7) = 𝑐𝑠𝑝𝑒𝑘𝑡𝑟(2,3) 9,74 ∙ 10−5 𝑀 5. Berechnung der Konzentration in der entsprechenden Probe: 𝑐𝑃𝑟𝑜𝑏𝑒 = 𝑐𝑢𝑛𝑏 ∙ 𝑉𝑒𝑟𝑑ü𝑛𝑛𝑢𝑛𝑔𝑠𝑓𝑎𝑘𝑡𝑜𝑟 = 9,86 ∙ 10−5 𝑀 ∙ 50 = 4,93 ∙ 10−3 𝑀

Tabelle 7. Daten zur Ermittlung der Konzentration einer unbekannten Ethanol-Probe und die ermittelte Konzentration.

Ethanol-Bestimmung Küv 2 Küv 3 Küv 4 Küv 5 Küv 6 Küv 7 Küv 8 Küv 9

6,25 mM Lösung; 1:50 6,25 mM Lösung; 1:100 Unbek. Lösung; 1:50 Unbek. Lösung; 1:100

cBer bzw. cunb, M

Extinktion ∆𝐸 (0,225)

Mittelwert der Extinktion

cspektr 2-5 bzw cspektr 6-9, M

cProbe, M

1,25*10-4

0,604

0,604

9,74*10-5

-

0,349

5,63*10-5

-

0,476

7,68*10-5

4,93*10-3

0,295

4,76*10-5

5,28*10-3

0,357 -5

6,25*10

0,340 0,474

-5

9,86*10

0,477 0,299

5,28*10-5

0,290

8

Tabelle 8. Daten zur Ermittlung der Konzentration einer unbekannten NAD+-Probe und die ermittelte Konzentration

NAD+-Bestimmung

Küv 2 Küv 3 Küv 4 Küv 5 Küv 6 Küv 7 Küv 8 Küv 9

5 mM Lösung; 1:50 5 mM Lösung; 1:100 Unbek. Lösung; 1:50 Unbek. Lösung; 1:100

CBer bzw. cunb, M

Extinktion

Mittelwert der Extinktion

Cspektr 2-5 bzw cspektr 6-9, M

CPr, M

0,624

10,06*10-5

-

0,320

5,13*10-5

-

0,284

4,58*10-5

2,27*10-3

0,122

1,96*10-5

1,91*10-3

(0,322) 1*10-4

0,624 0,340

-5

5*10

0,300 0,294

-5

4,55*10

0,273 0,130

1,91*10-5

0,113

3.3 Bestimmung der Gleichgewichtskonstanten der ADH-Konzentration Bemerkung: Für die Berechnung des Mittelwerts der Extinktion siehe 3.2. Die Werten in der Tab. 3 wurden folgendermaßen ausgerechnet: 1. Eingesetzte Konzentrationen von NAD+/Ethanol: 𝑐𝑁𝐴𝐷/𝐸𝑡𝑂𝐻

𝑐𝐴𝑛𝑓𝑎𝑛𝑔 𝑉𝑔𝑒𝑠𝑎𝑚𝑡 𝑉𝑒𝑖𝑛𝑔𝑒𝑠𝑒𝑡𝑧𝑡 𝑐𝐴𝑛𝑓𝑎𝑛𝑔 ∙ 𝑉𝑒𝑖𝑛𝑔𝑒𝑠𝑒𝑡𝑧𝑡 𝑐𝑁𝐴𝐷/𝐸𝑡𝑂𝐻 = 𝑉𝑔𝑒𝑠𝑎𝑚𝑡 =

Beispiel (NAD+-Konzentration, Küv. 2,3): 𝑐𝑁𝐴𝐷/𝐸𝑡𝑂𝐻 =

5 𝑚𝑀 ∙0,10 𝑚𝐿 2,5 𝑚𝐿

= 2 ∙ 10−4 𝑀

2. Konzentration von Ethanal und NADH: Da bei der ADH-Reaktion sich Ethanal und NADH im Verhältnis 1:1 gebildet werden, sind ihre Konzentrationen gleich. Konzentration von NADH ist durch Extinktion zu berechnen: 𝛥𝐸 𝑐𝑁𝐴𝐷𝐻/𝐸𝑡ℎ𝑎𝑛𝑎𝑙 = 𝑑∙𝜀 0,081 = 1,31 ∙ 10−5 𝑀 Beispiel (Küv. 2,3): 𝑐𝑁𝐴𝐷𝐻/𝐸𝑡ℎ𝑎𝑛𝑎𝑙 = 𝐿 3 1 𝑐𝑚 ∙6,2 ∙10 𝑐𝑚∙𝑚𝑜𝑙

3. Konzentration der NAD+: Die NAD+-Konzentration im Gleichgewicht entspricht der eingesetzte Konzentration abzüglich die NADH-Konzentration. [𝑁𝐴𝐷+]𝐺𝐺𝑊 = [𝑁𝐴𝐷 +]𝑒𝑖𝑛𝑔𝑒𝑠𝑒𝑡𝑧𝑡 − [𝑁𝐴𝐷𝐻] Beispiel (Küv. 2,3): [𝑁𝐴𝐷+]𝐺𝐺𝑊 = 2 ∙ 10−4 𝑀 − 1,31 ∙ 10−5 𝑀 = (2 − 0,131) ∙ 10−4 𝑀 = 1,969 ∙ 10−4 𝑀 4. Konzentration des Ethanols: [Ethanol] lässt sich analog berechnen: [Ethanol]𝐺𝐺𝑊 = [Ethanol]𝑒𝑖𝑛𝑔𝑒𝑠𝑒𝑡𝑧𝑡 − [𝐸𝑡ℎ𝑎𝑛𝑎𝑙] 9

Beispiel (Küv. 2,3): [𝐸𝑡ℎ𝑎𝑛𝑜𝑙]𝐺𝐺𝑊 = 2,5 ∙ 10−4 𝑀 − 1,31 ∙ 10−5 𝑀 = (2,5 − 0,131) ∙ 10−4 𝑀 = 2,37 ∙ 10−4 𝑀 5. Konzentration der H+: [H+] lässt sich durch den pH-Wert des eingesetzten Puffers berechnen: [𝐻+] = 10−𝑝𝐻 Beispiel (Küv. 2,3): [𝐻+ ] = 10−8,8 = 1,58 ∙ 10−9 𝑀 6. Gleichgewischtskonstante K: [𝐻+ ] ∙ [𝑁𝐴𝐷𝐻] ∙ [𝐸𝑡ℎ𝑎𝑛𝑎𝑙] 𝐾= [𝐸𝑡ℎ𝑎𝑛𝑜𝑙] ∙ [𝑁𝐴𝐷+] Beispiel (Küv. 2,3): 𝐾 =

1,58∙10−9 𝑀 ∙(1,31∙10−5 𝑀)2 1,97∙10−4 𝑀 ∙ 2,37∙10−4 𝑀

= 0,5807 ∙ 10−11 𝑀 ≈ 5,81 ∙ 10−12 𝑀

Tabelle 9. Daten zur Ermittlung der Gleichgewichtskonstante K unter unterschiedlichen Bedingungen und die ermittelte Gleichgewichtskonstante

K ü v e tt e

Eingesetzte Konzentration, M

Extinkt ion

[NAD+]

[Ethanol]

-4

-4

2 3

0,112 2*10

2,5* 10

4 5

-4

2,5* 10

-4

-4

2*10

-4

0,063

2*10

5*10

0,103

4*10

-4

2,5* 10

(0,465)

[NAD+]

[Ethanol]

[H+]

1,31*10-5

1,87* 10-4

2,37*10-4

1,58* 10-9

6,11* 10-12

1,69*10-5

1,83* 10-4

2,33*10-4

1,58* 10-10

1,06*1 0-12

1,66*10-5

1,83* 10-4

4,83*10-4

1,58* 10-9

4,92*1 0-12

1,95*10-5

3,80* 10-4

2,30*10-4

1,58* 10-9

6,87*1 0-11

0,103

0,121 -4

[NADH]= [CH3CHO]

Ber. Konsta nte K, M

0,105

(0,263)

8 9

0,049

Berechnetete GGW-Konzentrationen, M

0,081

0,146

6 7

Mittelwert der Extinktion

0,121

3.4. Bestimmung der relativen Spezifischen Aktivität der ADH gegenüber verschiedenen Alkoholen Die Bestimmung der spezifischen Aktivität der ADH gegenüber verschiedenen Alkoholen erfolgte photometrisch und wurde anhand der Extinktionsänderung des an der Reaktion beteiligten NADH bei 339 nm in einem Zeitabschnitt von 2 Minuten verfolgt, die proportional zur gebildeten Menge an Produkt war. Beobachtet wurde somit die Reaktionsgeschwindigkeit bei Verwendung der verschiedenen Substrate. Die dabei betrachteten Substrate waren Ethanol, Methanol, 1-Propanol und 1-Butanol. Tabelle 10. Extinktionen des NADH nach 2 Minuten bei der ADH Reaktion mit verschiedenen Substraten

Substrat Ethanol

Extinktion (2 min) 0,200 10

Methanol 1-Propanol 1-Butanol

0,002 0,004 0,002

Die daraus resultierende Reaktionsgeschwindigkeit in µmol/min stellt ein Maß für die Untersuchung der spezifischen Aktivität des Enzyms dar. Für diese Berechnung ist jedoch die Extinktionsänderung pro Minute erforderlich. Tabelle 11. Angabe der Extinktionsänderungen des NADH pro Minute bei der ADH Reaktion mit verschiedenen Substraten

Substrat Ethanol Methanol 1-Propanol 1-Butanol

Extinktionsänderung (ΔE339/min) 0,100 0,001 0,002 0,001

Da die Extinktionsänderung von der Konzentrationsänderung des NADH (und folglich der Substratumsetzung zum Produkt) bedingt ist, kann man die Geschwindigkeit der Reaktion mit folgender Formel berechnen: 𝑣=

∆𝑐 )∗𝑉 min

(

𝜀∗𝑑∗∆𝑡

𝑣=

bzw.

∆𝐸(399 𝑛𝑚) min

(

)∗𝑉

𝜀∗𝑑∗∆𝑡
<...