P2E1V2 - Determinación del pKa de una solución de un aminoácido (glicina) PDF

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Determinación del pKa de una solución de un aminoácido (glicina), obtención de una gráfica a partir de los resultados obtenidos durante la titulación de la solución del aminoácido con la solución de NaOH 0.1 M...

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Práctica No. 2 Determinación de pKa Aguilar, María Fernanda, Caro Cortés, Blanca Adelí García Sánchez, Alvaro Nahim Hernández Ramos, Maribel [email protected] [email protected] [email protected] [email protected]

Palabras clave: pH, pKa, aminoácido. Resumen: En la naturaleza, existen diversas sustancias amortiguadoras que regulan los diferentes sistemas ácido/base de los organismos vivos. Dentro de la rama de la bioquímica, es importante conocer la capacidad amortiguadora que presentan algunas de ellas; conocer el pH en el que se encuentra el poder amortiguador de estas nos permite conocer los límites de la estabilidad de la sustancia. Los aminoácidos son moléculas orgánicas que presentan, un grupo amino y un grupo ácido, en concreto, un grupo carboxilo. Esto hace que tengan un comportamiento anfótero, y que puedan comportarse como ácidos o como bases. Para determinar los distintos pKa del aminoácido Glicina, se ha realizado una valoración ácido base, midiendo el pH de la disolución mientras se va titulando con una solución de NaOH 0.1 M y utilizando una gráfica para conocer el pH en el cual se encuentra el punto isoeléctrico del aminoácido, es decir el punto de la titulación donde las concentraciones del dador de protones y del aceptor de protones son iguales, en este punto el pH es numéricamente igual al pKa. En este caso se utilizó 20 mL de la solución de glicina y se midió el pH que mostraba antes de añadir NaOH con un potenciómetro calibrado, el cual se encontraba en 0.92; y posteriormente se agregó una solución de NaOH 0.1 M de gota en gota (0.1 mL aproximadamente) hasta que el pH dio una lectura de 11.77. Se elaboró una gráfica que muestra el cambio del pH de la solución del aminoácido conforme se agrega mayor cantidad de la solución de NaOH. En ella se marcó la línea de tendencia para poder identificar fácilmente el punto isoeléctrico que se encontró situado en el pH de 6.03, y este teóricamente se encuentra en 5.97, un valor sumamente cercano al obtenido experimentalmente. Abstract: There are various buffer substances that regulate the different acid / base systems of living organisms. Within the branch of biochemistry, it is important to know the buffer

capacity of some of them; knowing the pH in which the damping power of these is found allows us to know the limits of the stability of the substance. Amino acids are organic molecules that have an amino group and an acid group, specifically a carboxyl group. This makes them have an amphoteric conduct and can act as acids or as bases. To determine the different pKa of the amino acid glycine, acid base titration has been carried out, measuring the pH of the solution while titrating with a NaOH solution and using a graph to know the pH at which the isoelectric point of the amino acid is, that is to say where titration the concentrations of the proton donor and the proton acceptor are equal, at this point the pH is numerically equal to pKa. In this specific case, 20 mL of the glycine solution has been used and the pH indicate was shown before adding NaOH with a calibrated potentiometer, which was 0.92; and subsequently 0.1 M solution of NaOH was added dropwise (approximately 0.1 mL) until the pH read 11.77. A graph has been drawn up showing the change in pH as more of the NaOH solution is added. It has marked the trend line to easily identify the isoelectric point that was located at the pH of 6.03, and this theoretically is at 5.97, a value very close to that obtained experimentally, so we conclude a good practice was performed. Resultados: Tabla 1 Valores de la solución de NaOH añadida y valores del cambio de pH

Datos obtenidos mediante la medición constante del pH de la solución del aminoácido glicina durante su titulación con una solución de NaOH al 0.1M, las adiciones que se llevaron a cabo fueron de 0.1 mL aproximadamente (1 gota). Se tomo medida del valor inicial del pH de la solución del aminoácido antes de añadir cualquier cantidad de base, el cual se registró como 0.92. La titulación se llevo a cabo hasta que el valor de pH subió a un valor de 11.77, pues se pretendía llegar a un valor de 12 el cual no se logró obtener.

Gráfica 1 titulación del aminoácido

Gráfica obtenida a partir de los resultados obtenidos durante la titulación de la solución del aminoácido con la solución de NaOH 0.1 M, podemos observar el cambio del pH a medida que va aumentando la cantidad de solución básica añadida, se ha añadido una línea de tendencia para poder identificar el punto isoeléctrico del aminoácido, ubicado en el pH de 6.03, igualmente se han identificado los 2 pKas de este, ubicados en 2.1 para el primero y 9.75 para el segundo. Discusión. De acuerdo con los resultados obtenidos en esta en la realización de esta práctica logramos observar el comportamiento de una solución de un aminoácido (glicina) en medio ácido al ser titulada con una solución básica de NaOH al 0.1M. Como se sabe los aminoácidos son moléculas orgánicas con un grupo amino (-NH2) y un grupo carboxilo (-COOH) (Lehninger, 2000) y en disolución acuosa se encuentran ionizados, lo cual les permite actuar tanto como base como ácidos, es decir que pueden actuar como una solución buffer o amortiguadora. La molécula de la glicina está formada por un átomo de carbono central al que se unen un radical carboxilo (COOH) y un radical amino (NH2). Los dos radicales

restantes corresponden al hidrógeno, por lo que es el único aminoácido que tiene dos radicales iguales y no posee isomería óptica (es no quiral) (Fernandez-Sanchez, 2008) Los aminoácidos como la glicina, donde el grupo amino se encuentra en la primera posición a partir del grupo carboxilo se denominan alfa aminoácidos (α-aminoácidos) Una disolución amortiguadora, llamada también disolución reguladora, buffer o tampón, es aquella que tiene la capacidad de regular los cambios bruscos de pH debidos a la adición de ácidos o bases fuertes y de resistir los cambios de pH por efecto de diluciones (Skoog et al, 2001). Las disoluciones amortiguadoras son frecuentes en la naturaleza, como es el caso del sistema H2CO3/NaHCO3 que predomina en el plasma y fluido intersticial (Vega & Konigsberg, 2001). El proceso para la realización de la titulación comenzó con la calibración del potenciómetro para disminuir en mayor medida errores en la medición del pH de la solución que estábamos trabajando y fue seguido de la medición de los 20 mL iniciales de la solución del aminoácido glicina al 0.025 M la cual teóricamente posee un pH de 2 (Sánchez Medina, 2020). La medición arrojo un resultado de 0.92, lo cual podría deberse a un fallo en la calibración del potenciómetro o al hecho de la solución del no se encontraba en la concentración requerida, o incluso que no se encontraba en las condiciones óptimas por antigüedad o errores en su almacenamiento. De todas formas, se continuo con el debido procedimiento y se tituló con la solución de NaOH gota a gota (0.1mL) para monitorear de lo más cerca posible el cambio de pH de la solución. A medida que más nos acercábamos al punto isoeléctrico el pH cambiaba en mayor medida en relación con la cantidad de NaOH añadido y en un punto se dio un salto brusco en el valor del pH y esto se debe a la valoración del ion catión de la glicina que dio el primer punto de inflexión, más adelante se presentó otro en menor medida pero igual importante que correspondió al segundo punto de inflexión de la glicina correspondiente al ion anión de esta (F. Daniels). En un punto muy importante la gráfica mostro un cambio en la medida en que cambiaba la medida del pH, en vez de seguir aumentando a grandes pasos, comenzó a reducir, y así fue hasta que se alcanzó la medida de pH de 11.77 y se logró apreciar un punto intermedio que era cruzado por la línea de tendencia. Todos los aminoácidos poseen un punto en el que se comportan como una sal neutra. En este punto la carga neta del aminoácido es nula ya que los dos grupos disociables tienen su carga de signo contrario y compensada. Este punto recibe el nombre de punto isoeléctrico (F. Daniels). En la gráfica de nuestros resultados podemos apreciar el punto isoeléctrico en el pH de 6.03 y es justo donde la línea de tendencia, que toma en cuenta los dos puntos de inflexión, corta la curva de titulación dada por los valores de pH contra los mililitros gastados. Teóricamente el punto isoeléctrico del aminoácido glicina se encuentra en 5.97 (Saber es práctico, 2013) y los pKas teóricos son 2,4; 9,8, (Dawson, R.M.C 1986) valores cercanos a los obtenidos experimentalmente por lo cual se puede deducir que se realizó una buena praxis.

Conclusión. La titulación de la glicina en medio acido con una base, nos permite observar en el grafico realizado el punto intermedio, en el que las concentraciones del ácido y de la base conjugada están en equilibrio, donde tenemos que el pH es igual a 6.03 y los pKas correspondientes son 2.1 y 9.75 Cuestionario: 1. Indicar el pKa de los siguientes ácidos: a) Ácido pirúvico: pKa 3.49 b) Ácido láctico: pKa 3.86 c) Ácido benzoico: pKa 4.202 d) Ácido oxálico: pKa1 1.25 pKa2 4.26 e) Ácido succínico: pKa1 4.20 pKa2 5.63 f) Ácido carbónico: pKa1 6.35 pKa2 10.32 2 Identificar el nombre completo, pKa y peso molecular (o fórmula) de los siguientes compuestos usados como reguladores de pH en bioquímica: 

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TRIS: tris(hidroximetil)aminometano o Fórmula (HOCH2)3CNH2 o Peso molecular: 121,14 g/mol o pKa: 8.06 CAPS: N-cyclohexyl-3-aminopropanesulfonic acid o Fórmula C9H19NO3S o Peso molecular: 221.32 g/mol o pKa: 10.4 MES: 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid o Fórmula C6H13NO4S o Peso molecular: 195.2 g/mol o pKa: 6.15 TES: 2-[[1,3-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)propan-2-yl]amino]ethanesulfonic acid o Fórmula C6H15NO6S o Peso molecular: 229.25 g/mol o pKa: 7.550

3. ¿Para qué valores de concentración de los componentes de un buffer, tiene este la máxima capacidad buffer? Se considera que la máxima capacidad amortiguadora de un par conjugado se encuentra entre una unidad de pH por debajo y una unidad por encima del pK. La efectividad o la

capacidad amortiguadora máxima es cuando se tienen las concentraciones del ácido y la base en proporción de una unidad. Se dice que las disoluciones que poseen estas propiedades poseen “acidez de reserva” y “alcalinidad de reserva” 4. ¿Por qué los aminoácidos actúan reguladores del pH? Los aminoácidos son moléculas fundamentales para la construcción de las proteínas, dado que son sus unidades básicas. También son precursores muy importantes de moléculas denominadas oligopéptidos que funcionan como hormonas, o bien, son transformados para proporcionar energía en el ciclo de Krebs. Otras de sus funciones es servir como sistemas tampón o buffer... esto quiere decir que regulan el pH, dado que sus grupos laterales tienen funciones ácidas o básicas (-COOH y -NH2), que neutralizan medios básico o ácidos, respectivamente. 5. Definir ¿Qué es la capacidad buffer? Consiste en la facultad que presenta el agua en mantener constante el nivel de pH al añadirse ácidos o bases. Un tampón o buffer por lo general radica en sales solubles en agua que son productos resultantes de la reacción entre un ácido débil y una base fuerte. Bibliografía. D.L. Nelson, M.M. Cox. (2018). ESTRUCTURA Y CATÁLISIS . En LEHNINGER. PRINCIPIOS DE BIOQUIMICA(75-76). Séptima edición. Barcelona: Omega. Fernandez-Sanchez, E.; Diez-Guerra, F. J.; Cubleos, B.; Gimenez, C. Y Zafra, F. (2008) Mechanisms of endoplasmic-reticulum export of glycine transporter. Biochem. 669-681 Douglas A. Skoog, F. James Holler, Stanley R. Crouch. 2018. PRINCIPIOS DE ANÁLISIS INSTRUMENTAL. Séptima edición. España. Cengage Learning Vega Ávila Elisa, Konigsberg Fainstein Mina. 2001. La importancia biológica de los sistemas amortiguadores (23-27). División de Ciencias Biológicas y de la Salud. UNAM Dr. Alberto Sánchez Medina, M.C. Marcos F. Ocaña Sánchez, Dra. Yolanda Cocotle Ronzón, MIC. Maritza Moserrat González Juárez. (2020) Manual de Prácticas de Bioquímica. Xalapa, Veracruz. Universidad Veracruzana. F.Daniels y R.A. Alberty .(1961) Physical Chemistry. American Chemical Society. 2da Edición. Recuperado desde: https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ed038p639.1 SABER ES PRÁCTICO. (2013) Punto isoeléctrico de los aminoácidos naturales. Saber es práctico. Recuperado desde: https://www.saberespractico.com/bioquimica/puntoisoelectrico-de-los-aminoacidos-naturales/ Dawson, R.M.C., Elliott, D.C., Elliott, W.H., and Jones, K.M. (1986) Data for Biochemical Research (pp. 1-31). 3rd edition. Gomori, G., (1955). Preparation of buffers for use in enzyme studies. Methods Enzymology., 1ra edición, 138-146

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