Penicillium-Aspergillus-Trichoderma- Manual Lab micoly 2018 PDF

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GUIA DE LABORATORIO DE MICOLOGIA

Francisco Rodríguez Rincón, M.Sc., Ph.D. [email protected] 2018

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MICROHONGOS PRÁCTICAS N° 1, 2 y3 .

Penicillium, Aspergillus, Trichoderma

OBJETIVOS: Describir las características macroscópicas y microscópicas de algunas especies de los géneros Penicillium, Aspergillus y Trichoderma . MATERIALES POR GRUPO DE TRABAJO: Una placa de los siguientes hongos: Aspergillus níger, A. flavus, Penicillium chrysogenum, P.candidum, P. roquerfortii, P. cammembertii, Trichoderma harzianun, T. viredae Azul de lactofenol mechero pipetas Pasteur microscopio con objetivos 5x, 10x, 40x, 100x *bolsas plásticas *cubreobjetos y portaobjetos *Cinta pegante transparente *Cinta de enmascarar *asas recta y redonda *Lápiz para marcar en vidrio *Solución para desinfectar mesones y trapo o toallas de papel *Guantes desechables, cofia y tapabocas *Material aportado por los estudiantes PROCEDIMIENTO: A. Haga una descripción macroscópica de los hongos con la guía que está más adelante. Para la descripción macroscópica, observe la colonia del hongo y descríbala.

DESCRIPCIÓN MACROSCÓPICA Y MICROSCÓPICA DE LOS MICROHONGOS  Aplicar los conceptos básicos fundamentales de la micología. Conocer los aspectos morfológicos de los hongos.  Características macroscópicas de las colonias Los hongos presentan una gran diversidad de colonias que van desde aquellas similares a las bacterianas, producidas por el crecimiento de levaduras, hasta colonias muy algodonosas que cubren toda la superficie del cultivo, producidas por hongos filamentosos. La colonia de muchos hongos filamentosos puede variar considerablemente debido a la constitución nutritiva de los medios de cultivo, a la temperatura y al tiempo de incubación.

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Por tal motivo es fundamental conocer la composición del medio de cultivo y las condiciones de incubación del agente aislado. El agar Sabouraud es el medio de cultivo más utilizado para el aislamiento de hongos, incubándose a 37º cuando se sospecha de levaduras y a 28º cuando se buscan hongos filamentosos. El estudio de las características macromorfologicas de las colonias de los hongos junto con las características microscópicas del cultivo permiten diferenciar e identificar los diferentes géneros y especies. En la observación y análisis macroscópico de la colonia se deben considerar: 

Forma: circular, irregular, filamentosa, rizoidal.



Elevación: plana y extendida, elevada y limitada, convexa o umbilicada.



Textura: algodonosa, pulverulenta, granular, vellosa, aterciopelada, mucosa, cremosa, etc.



Aspecto: brillante o húmeda, opaca o seca.



Superficie de la colonia: lisa, plegada, sectorizada, cerebriforme, con surcos radiales.



Color: blanco, canela, salmón, negro, etc.



Margen o Bordes: liso (entero o neto), regulares, irregulares (ondulado, lobado)

 Pigmento: puede estar presente o no. Si está presente, se deberá definir el color, observándose el reverso de la colonia.

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ACTIVIDAD Nº 1: Observar y describir las características macroscópicas de las colonias fúngicas aisladas.

Morfoespe Morfoespe Morfoespe cie 1 cie 2 cies 3

Morfoespe cies 4

Morfoespe Morfoespe Morfoespe cie 7 cie 6 cie 5

Tipo de Hongo Forma Elevaci on Textura

Aspect o

Superfi cie Color Margen o bordes Pigmen to

B. Observación microscópica de estructuras fúngicas en montaje frescos: 1. Tomar una lámina y agregar una gota de líquido de montaje (agua, azul de lactofenol o lactofenol). 2. Flamear el asa al mechero y dejar enfriar. 3. Destapar el cultivo cerca del mechero. 4. Tomar una muestra de hifas o esporas con el asa y transferir sobre la gota de montaje 5. Colocar la laminilla sobre la muestra húmeda, inicialmente ubicar en un ángulo de 45º y luego dejar caer suavemente para evitar la formación de burbujas. Alternativamente, puede usar cinta pegante en lugar de laminilla. 6. Observar al microscopio en aumentos 5X, 10X, 40X, 100X. 7. Realizar un dibujo y describir las estructuras correspondientes.

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C. Describa las estructuras microscópicas: Hifas Septadas o aseptadas, color (hialina o dematiácea), pared (delgada, gruesa, lisa, rugosa). Esporangiosporas o Conidias? : color, forma, Nº de células por conidia, disposición de los septos en las conidias. Disposición de los esporangios o de las conidias en el conidióforo. Otras estructuras sobresalientes (ver fundamentos). ACTIVIDAD Nº 2: Consulte y observe, dibuje y señale las principales estructuras microscópicas de los hongos.  Características microscópicas de los hongos Blastoconidio: elemento unicelular globoso a elipsoide que se origina por gemación a partir de una célula madre.

Pseudohifa: Conjunto de células levaduriformes que no se han separado después de la nueva gemación.

Hifa cenocítica o no tabicada: estructura tubular de paredes paralelas que constituyen un filamento contínuo.

Hifa septada o tabicada: estructura tubular de paredes paralelas, dividida en compartimentos por septos. Pueden ser hialinas o dematiaceas. Clamidoconidio o clamidospora: células globosas u ovoides, de pared doble y gruesa, que se localizan a nivel terminal e interc Son estructuras de resistencia, producidas como respuesta a condiciones adversas del medio. Artroconidio (arthron: articulación, artículos): son células rectangulares de paredes gruesas que se forman por fragmentación de hifas septadas

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 Reproducción de los hongos En los hongos podemos reconocer dos tipos de talo; el vegetativo y el reproductor, con funciones claramente definidas: El talo vegetativo se desarrolla en la superficie del sustrato y su función principal es absorber nutrientes, crecer y sustentar al talo reproductor. El talo reproductor crece proyectándose en dirección vertical, perpendicular al talo vegetativo y desarrollan las células especializadas en la reproducción de la especie. Se entiende por reproducción a la formación de nuevos individuos que tienen todas las características típicas de la especie. En hongos puede haber dos tipos de reproducción: sexual y asexual. La reproducción asexual tan bien llamada anamorfa, imperfecta o vegetativa no incluye la unión de los núcleos compatibles, células sexuales u órganos sexuales. Le reproducción sexual tan bien llamada telemorfa o perfecta, en cambio, esta caracterizada por la unión de los núcleos sexuales. Por lo tanto, los propágulos de dispersión pueden ser de tipo sexual o del tipo asexual según el mecanismo que le de origen. La reproducción asexual es más importante para la propagación de la especie ya que origina la producción de numerosos individuos, particularmente porque el ciclo asexual se repite varias veces al año; en tanto el sexual, en muchos hongos se presenta una sola vez. Los conidios se forman a partir de la célula conidiógena (célula que por si misma o a partir de la cual se originan directamente los conidios) que se encuentran organizadas en estructuras de reproducción, las cuales pueden ser interna o externa. Actividad N° 3: haga los esquemas según corresponda: Estructuras de reproducción ASEXUAL INTERNA esporangióforo, esporangio, columela, esporangioconidio

EXTERNA conidióforo, fiálide, conidios

Estructuras de reproducción SEXUAL INTERNA ascocarpos, ascos y ascosporas

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FUNDAMENTOS DE TECNICAS DE COLORACIÓN DE ESTRUCTURAS FÚNGICAS Tan pronto se recogen muestras de hongos en el campo, el investigador las transporta al laboratorio donde puede aislarlos y cultivarlos, luego los examinará usando un microscopio para una identificación preliminar. Para ello es necesario hacer montajes frescos o permanentes en portaobjetos con apropiados reactivos de tinción, los cuales permiten visualizar o contrastar las estructuras fúngicas y mantenerlos en forma permanente para su estudio posterior. Una herramienta adicional es dibujar las estructuras y tomar fotografías con el fin de detallar características relevantes, desconocidas o críticas en la determinación de los taxa. Algunos de los reactivos de montaje son el glicerol diluido, KOH-Floxina, ácido láctico, lactofenol, azul de anilina-lactofenol, azul de algodón-lactofenol, reactivo de Melzer y PVLG (polivinil alcohol- ácido láctico- glicerol), los cuales permiten preservar las estructuras y teñirlas. Las células y los pseudotejidos fúngicos sin teñir también pueden ser observados con diferentes tipos de microscopios como los de campo brillante, contraste de fases, de fluorescencia o de interferencia de contraste. No obstante, la tinción mejora el contraste y la visibilidad de ciertas estructuras. En el caso de dermatofitos, el Hidróxido de potasio al 10% (solución de KOH) digiere parcialmente los componentes proteicos de la célula huésped, pero no actúa sobre los polisacáridos de las paredes celulares de los hongos. La tinta china o Nigrosina permite observar células levaduriformes capsuladas (Cryptococcus), sobre todo en Liquido cefalorraquídeo. Los polisacáridos capsulares rechazan la tinta china y la cápsula aparece como un halo claro alrededor de los microorganismos. Las paredes celulares de los hongos fijan el colorante blanco de calcoflúor aumentando considerablemente su visibilidad en los tejidos y otras muestras. Este colorante se emplea en lugar de KOH al 10% para el examen inicial de los materiales clínicos. También se emplea para aumentar la visualización de los elementos morfológicos de los cultivos puros de hongos. En algunos laboratorios ha suplantado al azul de lactofenol en muchas aplicaciones. Los organismos fluorescen con luz blanco-azulada o verde manzana, según la fuente luminosa que se utilice. El azul de lactofenol tiene tres funciones importantes a la hora de observar hongos filamentosos: el fenol destruye la flora acompañante, el ácido láctico conserva las estructuras fúngicas al provocar un cambio de gradiente osmótico con relación al interior del hongo generando una película protectora, el azul de algodón permite apreciar la estructura fúngica. Este último posee la capacidad de adherirse a la quitina presente en las hifas y conidias de los hongos macro y microscópicos. Es usado fundamentalmente como colorante de hongos microscópicos.

FUNDAMENTOS DE MORFOLÓGIA DE ALGUNOS MICROHONGOS Penicillium spp. (Descrito por Link en 1809). Clasificación taxonómica Reino: Fungi Phylum-Forma : Deuteromycota Clase: Deuteromycetes Orden: Moniliales Familia: Moniliaceae Género: Penicillium Características macroscópicas

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 Las colonias de Penicillium diferentes a las de Penicillium marneffei son de rápido crecimiento, plano, filamentoso y en textura es aterciopelado, lanoso o algodonoso.  Colonias inicialmente blancas y luego azul verdosas, gris verdosas, u olivosas, amarillas o rosadas. El reverso del cultivo es pálido a amarillo. Característica microscópicas  Excepto Penicillium marneffei, las hifas son septadas, hialinas, de 1.5 a 5 µm en diametro, conidióforos simples o ramificados, metulas, fiálies y conidias.  Metulas son ramificaciones secundarias que se forman en conidióforos.  Las métulas llevan las fiálides que tienen forma de botella.  Las fiálides se encuentran en las puntas de los conidióforos. Ellos forman grupos semejantes a brochas las cuales son referidas como penicilios.  Las conidias (2.5-5µm en diametro) son redondas, unicelulares, y visualizadas en cadenas no-ramificadas en las puntas de las fiálides. Descripción y habitat natural Excepto Penicillium marneffei (es dimórfico termo-tolerante), Penicillium es un género de hongos filamentosos. Ampliamente distribuidos en suelos, vegetación en descomposición, y en el aire. Penicillium marneffei es endémico específicamente del sudeste de Asia, donde infecta ratas bamboo, las cuales sirven como marcadores epidemiológicos y reservorios de infecciones humanas. Son consideradas contaminantes, pero pueden causar infecciones, particularmente en huéspedes inmunocomprometidos, como peniciliosis, keratitis, endoftalmitis, otomycosis, esofagitis necrotizante, pneumonia, endocarditis, peritonitis, e infecciones urinarias. Penicillium verrucosum produce la micotoxina ocratoxina A, la cual es nefrotoxica y carcinogénica. La producción de la toxina ocurre en granos y cereales de climas fríos. Algunas especies tienen teleomorfos que incluyen los géneros Eupenicillium, Talaromyces, Hamigera, y Trichocoma Especies. Los más comunes son Penicillium chrysogenum, Penicillium citrinum, Penicillium janthinellum, Penicillium marneffei, y Penicillium purpurogenum. Su identificación se basa en morfología macroscópica y microscópica. Aspergillus spp. (Descrita por Micheli ex Link en 1809) Clasificación taxonómica Reino: Fungi Phylum-Forma: Deuteromycota Orden: Moniliales Familia: Moniliaceae Genero: Aspergillus Características macroscópicas  Su identificación se realiza teniendo en cuenta la tasa de crecimiento, el color de la colonia y la termotolerancia.  Excepto para Aspergillus nidulans y Aspergillus glaucus, la tasa de crecimiento es rápida a moderadamente rápida. Mientras Aspergillus nidulans y Aspergillus glaucus crecen lentamente y alcanzan un tamaño de colonia de 0.5-1 cm después de incubación a 25°C por 7 dias en agar-Czapek-Dox, las otras especies crecen 1-9cm.  Las colonias de Aspergillus tienen una textura de vellosas a polvosas.

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 El color puede variar dependiendo de las especies. El reverso del cultivo es incoloro a pálido amarillo de la mayoria de los aislados. Sin embargo, puede ser púrpura a oliva en algunas cepas de Aspergillus nidulans y naranja a púpura en Aspergillus versicolor.  Aspergillus fumigatus es termotolerante y crece bien a temperatures mayores de 40°C (el rango de Tº de crecimiento es 20 a 50º). Esta propiedad es única para Aspergillus fumigatus entre las especies de éste género. Característica microscópicas Al comparar Aspergillus y Syncephalastrum, este último difiere del primero por la presencia de merosporangios y ausencia de fiálides. La morfología básica es igual en todas las especies. Sin embargo, algunas diferencias son claves para ciertas especies, junto con el color de la colonia: 1. Para todas las especies:  hifas son septadas y hialinas.  Los conidióforos se originan de una célula basal localizada en la hifa de soporte y termina en una vesícula en el ápice. La vesícula es típica del género Aspergillus.  La morfología y el color del conidióforo varía de unas especies a otras.  Cubriendo la superficie de la vesícula (cabeza radiada) o parcialmente solo en la superficie superior (cabeza columnar) se encuentran las fiálides, que tienen forma de botella, las cuales pueden ser uniseriadas y unidas a la vesícula directamente o biseriadas y unidas a la columna a partir de una célula de soporte (Métula).  Encima de las fiálides se encuentran las conidias (2-5 µm en diámetro) formando cadenas-radiales. 2. Rasgos específicos para ciertas especies:  otras estructuras microscópicas son esclerocios, cleistotecios, aleuriconidias y células Hulle. Estas estructuras son importantes para la identificación de las especies.  El cleistotecio es producido durante el estado de reproducción sexual. Es redondo, cerrado y lleva ascas, las cuales llevan las ascosporas.  El asca se dispersa alrededor cuando el cleistotecio se rompe.  El Aleuriconidio es un tipo de conidio producido por lisis de la célula que lo soporta. La base es truncada y lleva remanentes de la célula de soporte lisada. Estos remanentes son collarines anulares en su base.  La célula Hulle es larga, estéril y lleva un lumen pequeño. Al igual que el cleistotecio, está asociada con el estado sexual de algunas especies de Aspergillus Habitat natural Aspergillus es un hongo filamentoso, cosmopolita y ubicuo en la naturaleza. Comúnmente se puede aislar del suelo, plantas en descomposición y ambientes aéreos de interiores. El estado teleomórfico ha sido descrito en algunas especies, pero en otras solo se acepta el estado mitospórico, sin que se conozcan sus esporas sexuales. Especies El género Aspergillus incluye cerca de 185 especies. Veinte de ellas son causantes de infecciones en el hombre, llamadas aspegilosis. Por ejemplo, Aspergillus fumigatus es el más común, seguido por Aspergillus flavus, Aspergillus niger. Aspergillus clavatus, el grupo de Aspergillus glaucus, Aspergillus nidulans, Aspergillus oryzae, Aspergillus

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terreus, Aspergillus ustus, y Aspergillus versicolor son patógenos oportunistas, pero en menor grado. Algunos antígenos de Aspergillus son alergenos fúngicos y pueden iniciar aspergilosis broncopulmonar alérgica. Otras especies producen varias micotoxinas. Estas micotoxinas pueden producir, por ingestión, cáncer en animales. Por ejemplo, la aflatoxina induce carcinoma hepatocelular y es producida por A. flavus, el cual crece normalmente en alimentos como frutas y granos. Trichoderma spp. (Descrita por Persoon ex Gray en 1801) Clasificación taxonómica: Reino: Fungi Phylum: Deuteromycota Clase: Deuteromycetes Orden: Moniliales Familia: Moniliaceae Género: Trichoderma Característica macrocópicas Colonias de Trichoderma crecen y maduran en cinco días. A 25ºC en PDA las colonias son lanosas y se vuelven compactas. Desde el frente el color es blanco. A medida que las colonias se forman se vuelven azul-verdosas o amarillo verdosas, observándose circulos o anillos concéntricos. Por el reverso es pálido, canela o amarillo. Característica microscópicas Hifas hialinas septadas, conidióforos, fiálides y conidias. Trichoderma longibrachiatum y Trichoderma viride puede producir clamidosporas. Conidióforos son hialinos ramificados y tienen una disposición piramidal. Las fiálides son hialinas en forma de botella e infladas en la base. Ellas se unen al conidióforo en angulo recto. Pueden unirse en solitario o agrupadas. Las conidias (3 µm en diámetro) son unicelulares y redondas o elipsoidales. Son de pared suave o rugosa y se agrupan en cabezas . Estos agrupamientos son rotos durante la preparación de las láminas para microscopia. El color de las conidias es verde. Trichoderma harzianum Conidióforos ramificados e irregularmente verticilados, llevando grupos de fiálides divergentes. Conidias son verdes, algunas veces hialinas con paredes suaves o rugosas y formadas en cabezas v...