Práctica 3 - Lisis celular - Laboratorio de Operaciones Unitarias II PDF

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Teoría practica 3 - Lisis célular...

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Instituto Tecnológico de Sonora Práctica 3. – Laboratorio Operaciones Unitarias II LISIS CELULAR Introducción El rompimiento celular es una operación necesaria cuando el producto de interés se localiza en el interior de las células, ósea son metabolitos intracelulares. Para ello es necesario conocer el tipo de célula, la composición de la membrana y pared celular (si es que la poseen). Así se tiene que la susceptibilidad al rompimiento celular está en función al tipo de célula, esta susceptibilidad se presenta de mayor a menor de la siguiente manera: células animales, micelio, baterías Gram (+), bacterias Gram (-), levaduras y esporas. También es importante conocer si se puede aprovechar el transporte activo celular para la excreción de metabolitos y, con esto, se evitaría la necesidad de romper la célula. Así mismo es importante tener en cuenta para la selección del método de rompimiento celular 1) la naturaleza del producto intracelular, 2) la escala de la operación, 3) Velocidad, 4) Estabilidad del producto, 5) la pureza del producto, 6) el costo del método. Existen varios métodos para lograr dicho fin, desde una simple alteración química de las cubiertas celulares o permeabilización de la membrana, hasta el rompimiento completo de la célula. Los métodos de rompimiento celular se clasifican en físicos, químicos y la digestión enzimática.

Objetivo: Evaluar métodos físicos, en la eficiencia de rompimiento celular para la extracción de metabolitos intracelulares de interés.

Equipo: 1 Microscopio óptico 1 Vortex 1 Centrífuga

Materiales:

Reactivos:

10 Tubos de ensayo (10 mL)

1 Sobre de levadura (panificación)

3 Pipetas Pasteur

5 g NaCl

5 Portaobjetos

Hielo

5 Cubreobjetos 3 Vasos precipitado de 150 mL 2 Matraz Erlenmeyer 250 mL 1 Mortero con pistilo (grande) 1 Vaso para licuadora 1 Base de licuadora (eléctrico) 4 Hojas de papel filtro Whatman #1 2 Embudos de vidrio (medianos) 1 Cámara de Neubauer Papel limpia lentes Perlas de vidrio (100 – 150 μm de diámetro)

Desarrollo experimental: Como primera actividad se prepara una suspensión de levadura, en la cual se vierte un sobre de levadura liofilizada (sobre de levadura de pan) en un matraz Erlenmeyer con 250 ml de agua destilada y 1 g de sacarosa, a una temperatura de 26 a 30 °C. Una vez activada la levadura se procede a realizar los experimentos siguientes, los cuales se dividen en tres partes:

PARTE 1: ROMPIMIENTO CON PERLAS DE VIDRIO 1.- Se prepara un frotis fresco de la suspensión de células y se observa al microscopio, se verifica que todas las células estén completas. Tomar evidencia fotográfica. 2.- Se adiciona 1 volumen de bolas de vidrio al tubo. 3.- Se adiciona 1 volumen de células de levadura a desintegrar (en forma de pasta, previamente separadas del caldo por filtrado en papel filtro ). 4.- Se adiciona 0.5 volumen de buffer. Se puede adicionar un 5% de algún detergente como Triton X-100 o SDS. 5.- Se agitan fuertemente en un vortex, entre 2 y 5 minutos (controlando que no se caliente). 6.- Se repite el punto 4 (aumentando 5 minutos en cada paso) hasta asegurar que no se rompen más células, mediante observación al microscopio. Tomar evidencia fotográfica. 7.- Se determina la eficacia del método al determinar el porcentaje de ruptura celular por medio de conteo en cámara de Neubauer.

PARTE 2: ROMPIMIENTO CON ULTRASONIDO Se utilizan frecuencias de 20 Khz esto produce vibraciones que provocan el fenómeno de cavitación. Se producen zonas de baja presión en el líquido, el líquido se transforma en gas formándose pequeñas burbujas, las burbujas colapsan debido a los cambios de presión y se producen fuertes esfuerzos de corte en el líquido que rompen las células. Para lo anterior se utilizarán 2 métodos: el baño de ultrasonidos y el sonicador de varilla.

MÉTODO A.- BAÑO DE ULTRASONIDO 1.- Se prepara un frotis fresco de la suspensión de células y se observa al microscopio, se determina la concentración celular (conteo en cámara de Neubauer). Tomar evidencia fotográfica. 2.- Se llena el nivel de agua (destilada) del baño de ultrasonidos hasta la marca, se pone hielo al agua, para evitar el aumento de la temperatura. Se colocan dos tubos con la suspensión de células resuspendidas en 5 ml de NaCl 0.1% (en forma de pasta, previamente separadas del caldo), observando cada 30 min hasta que se tenga la ruptura celular completa. Asegurarse de tomar foto de la observación al microscopio de cada muestra. 3.- Comparar el estado de ruptura celular de cada muestra, determinando la eficiencia de rompimiento en conteo directo (cámara de Neubauer).

MÉTODO B.- SONICADOR DE VARILLA 1.- Se prepara un frotis fresco de la suspensión de células y se observa al microscopio, se determina la concentración celular (conteo en cámara de Neubauer). Tomar evidencia fotográfica. 2.- Se coloca la suspensión de celular en forma de pasta, previamente separadas del caldo y resuspendidas en 5 ml de NaCl al 0.1% en un tubo de vidrio, se pone en un vaso con hielo y se prepara un soporte universal con el sonicador y unas pinzas para sostener un vaso de precipitado de 150 ml. 3.- Se introduce la varilla del sonicador en el tubo más debajo de la mitad del volumen, cuidando que no toque las paredes y el fondo del tubo. 4.- Se fija bien el tubo en el vaso con hielo y se enciende el sonicador durante 1 min. 5.- Se toma una muestra con una pipeta Pasteur. 6.- Se prepara un frotis fresco y se observa al microscopio para observar el grado de ruptura celular. 7.- Se toma foto de lo observado en el microscopio. 8.- Si no se ha logrado la ruptura celular, se repite la secuencia de pasos del 3 al 7 hasta que se rompan todas las células. 9.- Registrar el tiempo total de sonicación.

PARTE 3: ROMPIMIENTO CELULAR CON AGENTE SURFACTANTE 1.- 1.- Se prepara un frotis fresco de la suspensión de células y se observa al microscopio, se determina la concentración celular (conteo en cámara de Neubauer). Tomar evidencia fotográfica. 2.- Se coloca la suspensión celular en forma de pasta, previamente separadas del caldo y resuspendidas en 5 ml de Tween 20 o Triton X-100 en un tubo de vidrio, se pone en agitación durante 2 h. 3.- Se toma muestra con una pipeta Pasteur. 4.- Se prepara un frotis fresco y se observa al microscopio para observar el grado de ruptura celular. 5.- Se toma foto de lo observado en el microscopio. 6.- Si no se ha logrado la ruptura celular, se repite la secuencia de pasos del 3 al 7 hasta que se rompan todas las células. 7.- Registrar el tiempo total de contacto....