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Profa Hernández Ochoa Entrega: 05 de Octubre de 2019Práctica No. 3“Transporte a través de la membrana”1 Calixto Olvera Jazmín, De la Mora Mendoza Alejandra Celic, González Vargas Juan Carlos, López Espitia Lizbeth, Romero Sánchez Claudia Estrellit​aUNAM, Facultad de Ciencias, Biología, Biología Mole...

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Práctica No. 3 “Transporte a través de la membrana” 1

Calixto Olvera Jazmín, De la Mora Mendoza Alejandra Celic, González Vargas Juan Carlos, López Espitia Lizbeth, Romero Sánchez Claudia Estrellita Profa.Beatriz Hernández Ochoa Entrega: 05 de Octubre de 2019

UNAM, Facultad de Ciencias, Biología, Biología Molecular de la Célula II

______________________________________________________________________ Resumen: En la respectiva práctica se determinó el tipo de transporte que utiliza Saccharomyces cerevisiae para las moléculas de glucosa. Se realizó la preparación de las células de levadura, se incubaron y se hizo una cuantificación de glucosa a partir del método de Nelson-Somogyi y su respectiva curva patró para determinar dicha consentración.

Introducción Debido a su interior homofóbico, la bicapa de una célula impide el paso a la mayoría de las moléculas polares. Esta función de barrera permite a la célula mantener en su citosol ciertos solutos a concentraciones diferentes a fes que están en el líquido extracelular y en cada uno de los compartimientos intracelulares delimitados por una membrana. Sin embargo, para aprovecharse de esta barrera las células han tenido que desarrollar sistemas para transportar moléculas hidrosolubles e iones a través de sus membranas de forma específica y así poder incorporar los nutrientes esenciales, excretar los productos residuales del metabolismo y regular las concentraciones intracelulares de iones. Las células utilizan proteínas transmembrana para transportar iones inorgánicos y pequeñas moléculas orgánicas hidrosolubles a través de la bicapa. Con tiempo suficiente, casi cualquier molécula acabará difundiendo a través de una bicapa lipídica libre de proteína a favor de su gradiente de concentración. Sin embargo, la velocidad de difusión varía en gran medida, dependiendo en parte del tamaño de la molécula y, sobre todo, de su solubilidad relativa en aceite. En general, cuanto menor es la molécula y cuanto más soluble en aceite (es decir, tanto más hidrófoba o no polar es) más rápidamente difunde a través de una bicapa. Las moléculas pequeñas no polares, como el O2 y el CO2, se disuelven con facilidad en las bicapas lipídicas y, por lo tanto, difunden con rapidez a través de ellas. Las moléculas pequeñas polares pero no cargadas, como el agua o la urea, también difunden a través de una bicapa, aunque mucho más despacio. Por el contrario, las bicapas lipídicas son muy impermeables a todas las

moléculas cargadas (iones), por muy pequeñas que sean: la carga y el elevado grado de hidratación de tales moléculas les impiden penetrar en la fase hidrocarbonada de la bicapa. Así, las bicapas lipídicas sintéticas son 109 veces más permeables al agua que a los iones, incluso a los de tamaño tan reducido como el Na+ o el K+ . Como las bicapas lipídicas sintéticas, las membranas celulares permiten el paso por simple difusión del agua y de las moléculas no polares. Sin embargo, las membranas celulares también son permeables a diversas moléculas polares que atraviesan con gran lentitud las bicapas lipídicas sintéticas, tales como iones, azúcares, aminoácidos, nucleótidos y muchos metabolitos celulares. Unas proteínas de membrana especiales transfieren, estos solutos a través de las membranas celulares. Estas proteínas, que reciben el nombre de proteínas de transporte a través de la membrana, se presentan en muchas formas y en todos los tipos de membranas biológicas. Cada proteína está destinada al transporte de una clase particular de moléculas como (iones, azúcares o aminoácidos) y con frecuencia únicamente de una cierta especie molecular de la clase. Existen dos clases mayoritarias de proteínas de transporte de membrana; los transportadores y los canales. Los transportadores (también denominados carriers o permeasas] se unen al soluto que va a ser transportado específicamente y sufren una serie de cambios conformacionales que permiten la transferencia del soluto a través de la membrana. Por otro lado, los canales interactúan con el soluto que va a ser transportado de una forma mucho más débil. Forman

poros acuosos que atraviesan la bicapa lipídica; cuando estos poros se abren, permiten que determinados solutos (por lo general, iones inorgánicos de tamaño y carga apropiados) puedan pasar a su través y, por lo tanto, atravesar la membrana. No sorprende que el transporte a través de los canales se produzca a una velocidad mucho mayor que a través de los transportadores. A pesar de que el agua puede difundir a través de las bicapas lipídicas sintéticas, todas las células contienen proteínas canal específicas (llamadas canales de agua o acuaporinas) que aumentan notablemente la permeabilidad de estas membranas al agua. Objetivos ● Determinar el tipo de transporte de glucosa que realiza Saccharomyces cerevisiae Hipótesis Los mecanismos de transporte son específicos para cada tipo de soluto y solvente que desea traspasar la membrana semipermeable plasmática ya que estos tienen propiedades (físicas y químicas) y estructuras distintas. Algunos de los solutos no pueden traspasar la membrana por sí solos. Materiales, reactivos y equipos ￫1 sobre de Saccharomyces cerevisiae s eca algodón 1 marcador indeleble 1 piceta 2 gradillas 1 vasos de precipitados de 250mL ￫ 4 pipetas de 5mL ￫ 4 pipetas de 10mL ￫ 1 probeta de 10mL ￫ 26 tubos de ensayo ￫ 2 propipetas ￫ 1 mecheros ￫ 1 tela de alambre con asbesto ￫ 1 soporte universal con anillo ￫ 4 matraces Erlenmeyer de 250mL ￫ 1 matraz Erlenmeyer de 1000 mL ￫ 1 micropipeta de 1000μL ￫ 1 micropipeta de 200 μL ￫ 8 celdas de vidrio para espectrofotómetro ￫ 4 tubos para centrífuga para solventes ￫ Centrífuga ￫ Espectrofotómetro ￫ Vórtex ￫ Autoclave ￫ Incubadora con temperatura controlable

￫ Reactivo de arsenomolibdato ￫ Solución de glucosa 1 preparar 50mL de 0.15 mg/mL ￫ Solución de glucosa 2 preparar 500 mL 2 pinzas para tubos de 3 mg/mL 2,4-dinitrofenol 0.05% (NDP) ￫ Reactivo de Somogyi (soluciones 1 y 2) ￫ Solución de cianuro de potasio. Preparar 0.05% (KCN) Método A) Preparación de las células de levadura 1. Se etiquetaron 4 tubos de ensayo (a,b,c,d,e). 2. Se pipeteo en cada uno de los tubos los siguientes volúmenes de las soluciones de la Tabla 1. No. de tubo Soluciones (mL) A

B

C

D

E

Levadura (mg)

50

50

50

50

50

Solución de glucosa 1

1

1

1

1

1

0.1

0

0

0

0

0.1

0

0

Solución de DNP 0.05% 0 Solución de KCN 0.05%

0

Tabla 1. Cantidad que se debe agregar de solución en mililitros a cada uno de los tubos (1-4) para la preparación de las células de levadura. Se les agregó a todos los tubos 1mL de solución de glucosa 1 y 50mg de levadura, mientras que en las demás sustancias que son la solución de DNP 0.05% y la solución de KCN 0.05% llegaban a variar las cantidades.

3. Se tomó el tubo D y se puso a hervir 20 minutos. 4. Los tubos restantes se mezclaron invirtiendo uno por uno. 5. Al pasar los 20 minutos, se enfrió el tubo D en el refrigerador del laboratorio. B) Incubación de las células de levadura 1. Se etiquetaron 4 matraces Erlenmeyer de 250mL de la siguiente manera: (A,B,C y D) 2. Se agregaron 100 mL de la solución de glucosa 2 (la de 0.3%) a cada uno de los 4 tubos 3. Se vaciaron los tubos de levadura preparados en la sección anterior a cada uno de los matraces erlenmeyer Nota 1. En la sección anterior (A) se prepararon 5 tubos de ensayo, pero como el laboratorista nos proporcionó solo 4 matraces Erlenmeyer solo trabajamos con 4 tubos, es decir del tubo A al tubo D. 4. Se mezcló con Vortex cada uno de los matraces

5. Se tomó una alícuota de 10mL de cada uno de los matraces y se etiquetaron como tiempo cero de la siguiente manera: (t0a,t0b,t0c,t0d) 6. Se centrifugaron cada uno de los tubos a 4000 rpm durante 7 minutos

Tabla 2. Cantidad que se le debe agregar en mL a cada uno de los tubos (1-5) para la curva patrón del método de Nelson-Somogyi. Se les agregó a todos los tubos 2mL de reactivo de Somogyi mientras que para las demás sustancias que son la solución de glucosa y el agua destilada llegaban a variar las cantidades agregadas.

Nota 2: Esto debido a que nuestra centrifugadora solo tiene esa capacidad, no obstante el manual dicta que a 5000rpm por 5 minutos.

3. Se preparó un baño María para todos los tubos durante 20 minutos y se enfriaron a temperatura ambiente.

7. Se taparon con algodón los matraces y se incubaron a 37°C con agitación 8. Se tomó una alícuota de 10 mL de cada uno de los matraces a los 15 minutos y se etiquetaron con el tiempo 1 de la siguiente manera: (t1a,t1b,t1c,t1d) 9. Se repitió el paso 6 10. Se tomó una alícuota de 10 mL de cada uno de los matraces a los 30 minutos y se etiquetaron con el tiempo 2 de la siguiente manera: (t2a,t2b,t2c,t2d) 11. Se repitió el paso 6 12. Se tomó una alícuota de 10 mL de cada uno de los matraces a los 45 minutos y se etiquetaron con el tiempo 3 de la siguiente manera: (t3a,t3b,t3c,t3d) 13. Se repitió el paso 6 14. Se tomó una alícuota de 10 mL de cada uno de los matraces a los 60 minutos y se etiquetaron con el tiempo 4 de la siguiente manera: (t4a,t4b,t4c,t4d) 15. Se repitió el paso 6 16. Se tomó 1 mL del sobrenadante, se etiquetó y se metió al refrigerador a 4°C.

Nota 3: Se prendió el espectrofotómetro al mismo tiempo que se montó el baño María para no perder tiempo.

C) Cuantificación Nelson-Somogyi

de

glucosa

Método

t1 b

t1 c

t1 d

t2 a

t2 b

t2 c

t2 d

Tubo

6

7

8

9

10

11

12

13

Sobrena dante

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

Agua destilada

0.9

0.9

0.9

0.9

0.9

0.9

0.9

0.9

Reactivo de Somogyi

1

1

1

1

1

1

1

1

20 minutos en baño María. Enfriar bajo chorro de agua R de arsenom ilibdato

1

1

1

1

1

1

1

1

de

1. Se etiquetaron 5 tubos de ensayo de la siguiente manera (1,2,3,4,5) 2. Se agregaron los respectivos volúmenes de acuerdo a la Tabla 2 Soluciones (mL)

t1 a

No. de tubo 1

2

3

4

5

Solución de glucosa 1

0

0.2

0.4

0.6

0.8

Agua destilada

1

0.8

0.6

0.4

0.2

Reactivo de Smogyi

2

2

2

2

2

t3 a

t3 b

t3 c

t3 d

t4a

t4b

t4 c

t4 d

14

15

16

17

18

19

20

21

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

0.9

0.9

0.9

0.9

0.9

0.9

0.9

0.9

1

1

1

1

1

1

1

1

20 minutos en baño María. Enfriar bajo chorro de agua. 1

1

1

1

1

1

1

1

Tabla 3. Cantidad que se le debe de agregar a lo tubos (6-21) en mL. .Sobrenadante obtenido de la sección B de la incubación de la levadura con medio rico en glucosa.

4. Se mezclaron uno por uno en el vortex 5. Se agregó a cada uno 7mL de agua destilada 6. Se leyeron los tubos en el espectrofotómetro, tomó el tubo 1 como blanco y se leyeron los tubos restantes a 540 nm 7. Se registraron las observaciones y resultados 8. Se desecharon los reactivos respectivamente donde corresponden cada uno de ellos. Resultados a) Tabla para la curva patrón

a

0.449

0.342

0.423

0.431

b DNP

0.460

0.397

0.424

0.465

c KCN

0.414

0.377

0.413

0.438

d Calor

0.427

0.457

0.420

0.419

Tabla 4. Valores de absorbancia de cada uno de los tubos (6-21) medidos con el espectrofotómetro a una absorbancia de 540 nm.

Tratamiento No. Tubo

ABS

Tiempo de incubación en min.

540nm

1

0

2

0.408

3

0.490

4

0.598

5

0.601

Tabla 3. Valores de absorbancia de cada uno de los tubos (1-5) medidos en el espectrofotómetro a una absorbancia de 540 nm de la curva patrón del método de Nelson-Somogyi. Con estos valores se construirá la curva patrón.

t0

t1

t2

t3

0

15

30

45

a

0.442

0.288

0.405

0.416

b DNP

0.458

0.367

0.406

0.465

c KCN

0.392

0.339

0.390

0.426

d Calor

0.410

0.454

0.400

0.399

Tabla 5. Valores de la cantidad de glucosa en las muestras problema (tubos 6-21) utilizando la ecuación de la recta y el despeje de “x” dada por la gráfica 1.

Gráfica 1. Absorbancia vs concentración de glucosa. n=g/PM

t1

t2

t3

a

0.00085

0.00020

0.00014

b DNP

0.00050

0.00028

c KCN

0.00029

1.1111e-05

d Calor Gráfica 1. Curva estándar donde en el eje de las “X” se encuentra la concentración de la solución de glucosa (mL) de los tubos (1-5) y en eje de la “Y” se encuentra la absorbancia de 540 nm de cada uno de estos tubos. Se obtuvo la ecuación de la recta que es “y=0.696x-0.141” a partir de estos datos.

Tratamiento

Tiempo de incubación en min. t0

t1

t2

t3

0

15

30

45

5.5555e-06

6.1111e-05

Tabla 6. Resultados de concentración de glucosa en moles transportados por la célula de los tratamientos de "a", "b",

"c" y "d" en cada uno de los tiempos (t1, t2, t3). Discusión Podemos apreciar que en las muestras problemas (tubos 6-21), en los tubos con el tratamiento a,  b, c y d con sus respectivos tiempos de incubación; inician con una elevada cantidad de colesterol, posteriormente esta cantidad disminuye o se eleva nuevamente dependiendo del tubo. En los tubos a no encontramos una diferencia significativa ya que aquí ocurre el metabolismo normal

de la célula. En los tubos b la concentración baja porque la concentración de la glucosa en el medio se fue consumiendo por la célula. En los tubos c con la presencia de cianuro, éste actúa como inhibidor en el último complejo de la cadena respiratoria, el citocromo c donde los electrones pasan el oxígeno, entonces no hay producción de este elemento, el cianuro es un tóxico y hace que la célula muera cuando esto ocurrió hubo una estabilidad en valores de concentración.. Para los tubos d, el calor hizo que la membrana fuera más permeable y esto a su vez provocó la lisis de la célula es por ello que la concentración se mantuvo. Esto es debido a que la glucosa ingresa a la célula en cuatro etapas: 1. Se une a transportador en la cara externa de la membrana, 2. El transportador cambia de conformación, la glucosa; y si sitio de unión quedan localizados en la cara interna de la membrana, 3. El transportador libera la glucosa al citoplasma, 4. El transportador libre cambia nuevamente de conformación, expone el sitio de unión a la glucosa en la cara externa y retorna a su estado inicial.

En los cálculos para obtener la concentración de glucosa en moles ocurrió que la diferencia de concentraciones por tiempo fue negativa, lo que indica que hubo un error en las mediciones de absorbancia provocados probablemente por errores experimentales. Conclusiones La membrana plasmática está formada casi en su totalidad por una bicapa de lípidos con gran número de moléculas proteicas flotando en el seno de las estancias lipídicas. Existen diversos factores que regulan la actividad de intercambio en la membrana: las características fisicoquímicas, una fuente de energía y la permeabilidad (conferido por bombas y canales hacen que sea o no eficiente el transporte de fructosa y glucosa en Saccharomyces cerevisiae) . En Saccharomyces cerevisiae e l tipo de transporte depende de la afinidad por la glucosa y la capacidad del transporte a través de la membrana. Si existe una baja afinidad por la glucosa la capacidad de transporte va a ser alta (hxt1 y hxt3), mientras que si existe una alta afinidad por la glucosa la capacidad de transporte va a ser baja y está va estar mediado por los transportes de tipo hxt2, hxt4, hxt7. Bibliografía ● Alberts, B., et. Al. (2008). Biología molecular de La Célula.  U.S.A.:OMEGA, pp.651-653. ● Garrahan, P. J., & Rega, A. F. (1977). Transporte a través de la membrana celular.

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Programa Regional de Desarrollo Científico y Tecnológico, Departamento de Asuntos Científicos, Secretaría General de la Organización de los Estados Americanos. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Universidad de Buenos Aires. Argentina. 80 pp. Raisman, J. y González, A. M. (2013). La membrana celular. Argentina. Recuperado de: http://www.biologia.edu.ar/cel_euca/la_membra na_celular.htm Velez, J. (2010). Laboratorio 7: La membrana y el transporte celular. Recuperado el 24 de Julio de 2011, de http://academic.uprm.edu/~jvelezg/lab7.pdf

Cálculos Concentración de glucosa de las muestras problemas (tubos 6 y 21) y = 0.696x + 0.141 Despejamos a x y−0.141 x = 0.696 Sacamos la concentración de glucosa de cada una de las muestras ￫ Para “a” en t0 = 0.442 x = 0.449−0.141 0.696 ￫ Para “a” en t1 x = 0.342−0.141 = 0.288 0.696 ￫ Para “a” en t2 = 0.405 x = 0.423−0.141 0.696 ￫ Para “a” en t3 x = 0.431−0.141 = 0.416 0.696 ￫ Para “b” en t0 = 0.458 x = 0.460−0.141 0.696 ￫ Para “b” en t1 x = 0.367−0.141 = 0.367 0.696 ￫ Para “b” en t2 = 0.406 x = 0.406−0.141 0.696 ￫ Para “b” en t3 x = 0.465−0.141 = 0.465 0.696 ￫ Para “c” en t0 = 0.392 x = 0.414−0.141 0.696 ￫ Para “c” en t1 x = 0.377−0.141 = 0.339 0.696 ￫ Para “c” en t2 = 0.390 x = 0.413−0.141 0.696 ￫ Para “c” en t3 x = 0.438−0.141 = 0.426 0.696 ￫ Para “d” en t0

x = 0.427−0.141 = 0.410 0.696 ￫ Para “d” en t1 x = 0.457−0.141 = 0.454 0.696 ￫ Para “d” en t2 x = 0.420−0.141 = 0.400 0.696 ￫ Para “d” en t3 x = 0.419−0.141 = 0.399 0.696 Para determinar la concentración de glucosa en moles: Tratamiento a: t0-t1= 0.442-0.288=0.154 g/180g/mol=0.00085 mol t0-t2=0.442-0.405=0.037 g/180g/mol=0.00020 mol t0-t3=0.442-0.416=0.026 g/180g/mol=0.000144 mol Tratamiento b: t0-t1= 0.458-0.367=0.091 g/180g/mol=0.00050 t0-t2=0.458-0.406=0.052 g /180g/mol=0.00028 t0-t3=0.458-0.465=-0.007g (error) Tratamiento c: t0-t1=0.392-0.339=0.053 g/180...