Practica -microcultivo PDF

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Incluye imágenes, discusión y conclusión...

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Laboratorio de Parasitología

Practica 6 Microcultivo

INTRODUCCION Los hongos forman parte de la humanidad desde su origen, son organismos vivos muy extendidos en la naturaleza, ubicados desde hace más de treinta años en su propio reino: Fungae. En los años cincuenta, se identificaron unas 20 especies patógenas, sin embargo hoy en día se han demostrado más de 400 con papel patógeno, siendo en su mayoría, hongos saprófitos oportunistas. 1 Se presentan en huéspedes inmunocomprometidos mayoritariamente y utilizan mecanismos de patogénicos muy variados, algunos están en la pared celular, como la cápsula y el pigmento. 1 Diversos factores como modificaciones en el medio ambiente, utilización de procedimientos invasivos (catéteres, prótesis cardiovasculares), alteraciones inmunitarias (trasplantes, quimioterapia) y SIDA, están cambiando los patrones epidemiológicos de micosis endémicas. Ahora es mucho más preciso el diagnóstico gracias al desarrollo de procedimiento inmunológicos y sobre todo de técnicas de biología molecular. 1 Características generales de los hongos Los hongos son organismos eucariontes con núcleos organizados, cuya membrana nuclear está bien definida son aerobios, heterótrofos y en general no motiles, sin embargo existen algunos hongos flagelados. Se reproducen por esporas sexuales y asexuales. Tienen 2 tipos de células: las somáticas que incluyen núcleos muy pequeños cuyo proceso de división es por mitosis ordinaria, las reproductoras que contienen núcleos mucho más grandes y cuya división celular es por meiosis. Hongos Filamentosos o Mohos Son hongos formados por hifas, una serie de ramas tubulares, las cuales en conjunto forman el micelio. Se reproducción se da por la formación de esporas, que pueden ser pigmentadas, dandole el color al hongo. Al centro de la colonia se ubican las hifas fértiles que dan origen a las esporas, razón por la cual los hongos son más coloreados en esa zona. Se caracterizan por presentar crecimiento rápido, tener reservorios naturales en el suelo, plantas, animales y vegetales muertos, crecen a temperaturas de 25 – 30°C y sus esporas o conidios son transportados por el aire, son normalmente inhalados y presentan gran resistencia en el medio ambiente. 5 La mayoría de los hongos filamentosos que representan un interés clínico y vegetal, tienen una fase de reproducción sexuada (telomorfa), pero es su forma asexual (anamórfica) la que casi siempre produce las enfermedades y es observada en las muestras. 5 Sus condiciones de crecimiento varían entre 0 a 55°C con un temperatura optima entre 20 y 30°C las generales, de acuerdo a la temperatura se pueden clasificar como Psicrofilo, mesofilos y termófilos, siendo

Rango 0°C y 20°C 0°C y 50°C 20°C y 50°C

Optima 15°C y 17°C 15°C y 40°C 35°C y 40°C

Microcultivo Este se trata del procedimiento idóneo para la identificación de estructuras fúngicas, ya que permite la visualización microscópica del micelio en su conjunto no solo una parte del mismo, como ocurre con el método de disociación. 4 Los cultivos en placa se obtienen con la siembra por picadura el centro de las cajas que contienen los mismos medios. Se utilizan otras técnicas para obtener cultivos puros y demostrar mediante los postulados de Koch que hemos aislado el agente etiológico adecuadamente. 4 Es de utilidad para la observación de conidios sobre los conidióforos y la morfología estructural de estos, al efectuar el preparado correspondiente se desprende y se rompen. De esta manera con el uso de estos métodos y de la microscopia es posible el estudio del crecimiento y la esporulación en todos sus detalles. 4 El procedimiento es desarrollado sobre un portaobjetos, en el cual se coloca un cuadrito del medio de cultivo sólido para hongos sobre el que se deposita un gel y la laminilla es incubada en una cámara húmeda que posteriormente ser observada microscópicamente. 4

Objetivo Conocer la técnica de microcultivo para la caracterización de estructuras somáticas y reproductivas e identificar morfológicamente a los hongos contaminantes. Preguntas de consulta 1.- ¿Cuál es el procedimiento más adecuado para identificar microscópicamente un hongo filamentoso (moho)? El microcultivo, con el Agar Sabouraud y/o harina de Maíz. 2, 4 2.- ¿Cuál es el instrumento básico para manipular colonias de hongos filamentosos (mohos) en el laboratorio y por qué? Cajas de Petri ya que permiten el estudio de colonias, durante el tiempo de incubación del microorganismo sembrado en la placa la cual se mantiene boca abajo, apoyada sobre la tapa. De tal manera, el agar queda en la parte superior y al condensarse el vapor de agua generado por los microorganismos debido a su metabolismo, cae sobre la tapa, evitando que los microorganismos se diluyan, manteniéndose fijo al sustrato. 3, 4. 3.- ¿Qué implicaciones tienen los hongos contaminantes en la salud y bienestar humanos? Perjudican de muy variadas maneras la salud humana por la diversidad de agentes patógenos, ocasionando distintos padecimientos mediante distintos medios de contagio que ponen en compromiso el bienestar humano con riesgos potencialmente mortales.

MATERIALES: Un palillo de madera Caja Petri Portaobjetos Cubreobjetos Agar Dextrosa Saboureaud Microscopio MUESTRA: Muestra de pan infectada con hongos SUSTANCIAS: Solución Lugol Hidróxido de Potasio (KOH al

PROCEDIMIENTO 1) Observación directa de la muestra en solución Lugol Colocar una gota de lugol en la porción central del portaobjetos

Tomar una muestra del hongo con el asa micologica

Colocar un cubreobjetos

Se observa al microscopio en 10x y 40x

Mezclar la muestra en la gota de lugol

2) Observación de la muestra en KOH al Colocar una gota de KOH al 10% en la porción central del portaobjetos

Tomar una muestra del hongo con el asa micologica

Colocar el cubreobjetos

Observar en el microscopio a 10x y 40x

Mezclar la muestra con la gota de KOH al 10%

3) Siembra de la muestra en Agar Dextrosa Saboureaud Preparar una caja petri cubierta con una servilleta y dos palillos dispuestos en forma paralela

Colocar el portaobjetos perpendicular a los palillos

Tomar una muestra del hongo e introducirlo en los 4 lados del cuadrado de agar

Colocar un cubreobjetos y cerrar la caja petri, rotular con nombre y fecha y almacenar por un periodo de 7 dias

Colocar un cuadrado de Agar Dextrosa Saboureaud aproximadamente de 1cm2 en el portaobjetos

Observación del hongo sembrado en Agar Dextrosa Saboureaud 7 días después

Preparar un portaobjetos

DIAGRAMA DE FLUJO

Abrir la caja petri cercas de una flama

Observar el crecimiento del hongo y colocar una muestra en un portaobjetos con solucion salina

PREPARACION DE MUESTRA EN LUGOL

PREPARACIÓN DE MUESTRA EN KOH AL 10%

PREPARACION DEL CULTIVO

CULTIVO 7 DIAS DESPUES

RESULTADOS

Blastoconidios 40x

Blastoconidios con hifas 40x

Blastoconidios 100x

Esporangio 100x

Micelio macrosifonado hialino y tabicado 100x

Hifas verdaderas macrosifonadas tabicadas Pigmentadas 100x

DISCUSIÓN El deterioro que causan los mohos se conoce como ``enmohecimiento``, y se manifiesta con la aparición de manchas contrastantes en la superficie del pan. Los mohos que suelen encontrarse en el pan son los géneros Aspergillus, Penicillinum, Mucor y Rhizopus.10 Cada uno tiene una morfología macroscópica y microscópica distinta, las cuales sientan la base para distinguir al de esta práctica. En este caso, el pan contaminado con hongos estaba previamente incubado con condiciones favorables para su desarrollo, luego se procedió a la incubación de este en un trozo de agar Saboraud, el cual, luego de una semana presentó un crecimiento moderado. El hongo del género Penicillinum, en crecimiento es predominante, ya que tiene una abundante producción de esporas y elevada presencia en el ambiente; sin embargo, la temperatura ideal es de 7 a 10 ° C,10 lo que lo descarta parcialmente, ya que la muestra que se utilizó creció en un rango de temperatura de 26°C. Macroscópicamente se presenta filamentoso de coloración azulada, sin embargo, se presentan microscópicamente conidióforos tabicados de pared lisa, con fiálides en forma de botella, de donde nacen conidios lisos y elipsoidales, sin ramificar. 9 Macroscópicamente coincide medianamente con la muestra de la cual se obtuvo el cultivo, sin embargo, microscópicamente no se encontraron las fiálides y métulas características en forma de ´´botella´´, por lo que se descarta este hongo. Las especies de Aspergillus mayormente encontradas son A. flavus, A. versicolor y A. sydowii, mayormente A. niger, es otra de las especies contaminantes que se consideran debido a su ubicuidad y a la morfología macroscópica es color azul verde, amarillenta o grisácea de su superficie, este crece a temperaturas de 22 a 24°C. 10 Este da una textura algodonosa, aterciopelada y granular, el cual crece en sustratos en descomposición, se encuentra formado por hifas hialinas septadas y puede tener reproducción sexual (con formación de ascosporas en el interior de ascas) y asexual (con formación de conidios). 8 Las cabezas aspergilares, las cuales son características de estos hongos, no se encontraron en la muestra, por lo que se considera que el hongo obtenido es rhizopus, el cual es del orden Mucorales. Estos, también son llamados ´´hongo negro del pan´´, macroscópicamente tienen el micelio grisáceo de aspecto algodonoso con esporangios negros,7 las cuales crecen idealmente a 37°C. Al microscopio se ven hifas verdaderas formadas a partir de la conidia, de aspecto rizoide, con micelio macrosifonado, hialino y cenocítico. Los esporangióforos son largos y no se ramifican, culminando es esporangios de gran tamaño. 6 Esta morfología coincide con la encontrada en la muestra, tanto microscópica como macroscópicamente.

CONCLUSIÓN El hongo rhizopus es un hongo ubicuo, conocido como el ´´hongo negro del pan´´ el cual suele causar la pudrición blanda en frutas y hortalizas, ocasionando grandes y graves pérdidas económicas. En este caso se identificó en un pan contaminado por este. Por medio de la práctica se identificó un hongo contaminante habitual del ambiente, inicialmente resultó difícil por la inexperiencia respecto al tema, sin embargo, gracias a la práctica se identificaron las estructuras principales morfológicas a nivel microscópico de los hongos y sus estructuras reproductivas, facilitando la comprensión del tema. Es probable, debido a nuestra inexperiencia en la práctica micológica, que no se haya identificado correctamente la especie del contaminante, sin embargo, fue de mucha ayuda para asentar bien las bases de la micología y la morfología tanto microscópica como macroscópica en la práctica micológica.

BIBLIOGRAFIA 1)

2)

3)

4)

5) 6) 7) 8)

9) 10)

Arenas R. (2012). La micología médica y sus retos en el siglo XXI. Medical mycology and its challenges in the XXI Century. Med Cutan Iber Lat Am, 40(5), 129-130. http://www.medigraphic.com/pdfs/cutanea/mc-2012/mc125a.pdf Barria K. 22/11/17. Identificación de Hongos. Identificar una especie de hongo filamentoso procedimiento. Observación macroscópica de mohos. (2013). Academia EDU. http://www.academia.edu/4213597/Identificaci %C3%B3n_de_HongosObjetivo_Identificar_una_especie_de_hongo_filamentoso_Proc edimiento_Observaci%C3%B3n_macrosc%C3%B3pica_de_mohos_Determinar Aquiahuatl M., Volke t., Prado L., Shirai K., Ramírez F. y Salazar M. (2012). Manual de prácticas de laboratorio Microbiología general. División de Ciencias Biológicas y de la Salud. 37-40. http://www.izt.uam.mx/ceu/publicaciones/MMBG/files/manual_microbiologia_genera l.pdf Peréz R. 22/11/17. Técnicas microbiológicas. 2017. Instituto Politécnico nacional, Secretaria de educación pública. http://www.biblioteca.upibi.ipn.mx/Archivos/Material %20Didactico/T%C3%A9cnicas%20microbiol%C3%B3gicas/T%C3%A9cnicas %20Microbiol%C3%B3gicas%20Parte%202.pdf Microbiología/Micología. 22/11/17. Wikilibros. 2017. https://es.wikibooks.org/wiki/Microbiolog%C3%ADa/Micolog%C3%ADa Bonifaz. (2012). Micología Médica Básica (4 ed.), Capítulo 5: Hongos contaminantes. México: McGrawHill. Página 63, 600p. Falconí, N., Espin, J., & Lascano, C. (2014). Estudio sobre el crecimiento de moho en el pan común. Ecuador. Hernández, A. M., Culver González, M., Asencio, C., & Lagoma Lorén, L. (2015). DATABiO: Fichas de agentes biológicos. Madrid: Instituto Nacional de Seguridad e Higiene en el Trabajo. Retrieved from http://www.insht.es/InshtWeb/Contenidos/Documentacion/FICHAS%20DE %20PUBLICACIONES/EN%20CATALOGO/HERRAMIENTAS%20PRL/Bases%20de %20datos/BD%20Databio/DATABiO.pdf Pontón, J., Moragues, M., Gené, J., Guarro, J., & Quindós, G. (2002). Hongos y actinomicetos alergénicos. Revista Iberoamericana de Micología, 36. Salgado-Nava, A., & Jimenez-Munguía, M. (2012). Métodos de control de crecimiento microbiano en el pan. Temas selectos de ingeniería de alimentos, 160-172....