Practica No 1 NYAP 2020 - b,mdmfmj dth dshdgfh dtgh PDF

Preview

Summary

b,mdmfmj dth dshdgfh dtgh...

Description

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS (Universidad del Perú. Decana de América) FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS MANUAL DE TRABAJO DE LABORATORIO: NEMATODOS Y ACANTOCEFALOS PARÁSITOS

Dr. JUAN JIMENEZ CHUNGA Mag. JULIA CASTRO HIDALGO

Alumno:_________________________________________ Código:___________

Lima – Perú 2020

Copyright © 2020. Todos los derechos reservados Edición General: Dr. JUAN JIMENEZ CHUNGA Colaboración: Mag. JULIA CASTRO HIDALGO Lima – Perú. UNMSM 2020 120 pp. TERCERA VERSIÓN

PRESENTACIÓN El presente manual de trabajo constituye un material muy importante para el reconocimiento de los principales Nematodos y Acantocéfalos parásitos que se encuentran en diferentes organismos como son el humano, ganado rumiante, aves, equinos, porcinos, peces, anfibios, reptiles y artrópodos. En plantas se muestran las principales formas de toma de muestra, diagnóstico e identificación de los principales nematodos que las afectan. Desde los métodos convencionales de diagnóstico, toma de muestra, hasta la preparación en montajes permanente, mostramos el presente manual para su utilización por los estudiantes y profesionales de las Ciencias Biológicas. Par su elaboración se ha recurrido a información de diversos autores, mediante la búsqueda de referencias bibliográficas actualizadas, asi como también a material fotográfico de la biodiversidad de nematodos y acantocéfalos aislados de diferentes organismos y coloreados en nuestro laboratorio.

Dr. Juan Jimenez Chunga 2020

PRÁCTICA 1 - Aplicación de las principales Técnicas para el estudio de nematodos. - Reconocimiento de las formas diagnósticas de los principales nematodos en humanos y animales. I. INTRODUCCIÓN

Para una identificación correcta de las formas parasitarias que se localizan en el tracto intestinal, es necesario conocer la toma de muestra, el manejo en el laboratorio y el empleo de una metodología indicada para su diagnóstico adecuado. II. MATERIALES

2.1 BIOLÓGICO Heces parasitadas de humanos Intestino de ovino, ave, bovino Heces de ganado 2.2 OTROS -Agua destilada - Cloruro de sodio - Formol -Sulfato de Zinc - Lugol -Tubos de prueba - Láminas y laminillas -Pipetas -Copas de sedimentación -Bagueta -Coladores - Placas de Petri III. PROCEDIMIENTO

3.1 EXAMEN DE HECES En los animales mayores, las heces se recogen inmediatamente de la parte superficial después de una evacuación normal en frasco de boca ancha y en los más pequeños, se usan tubos especiales. La muestra fecal debe ser recién emitida y no estar mezclada con orina u otra sustancia. Debe considerarse la parte más blanda, sin residuo con moco y sangre si lo hubiera. La muestra puede ser examinada en fresco o puede preservarse en Formol – sal. HECES HUMANAS: PREPARACIÓN DEL PACIENTE: 1. Laxante salino la noche anterior en caso de estreñimiento. De ninguna manera usar aceites como laxante. Si hay diarrea no se puede indicar laxante. 2. La muestra debe recoger se libre de orina. 3. Coloque en un frasco limpio de vidrio de plástico de boca ancha y con tapa de rosca para evitar desecación o el mal olor. 4. Remitir a la brevedad posible al laboratorio, en este debe proceder a su examen inmediato.

3.2 MÉTODOS CUALITATIVO DE DIAGNÓSTICO Examen Macroscópico.- Observación de los caracteres organolépticos de las heces no fijadas como: consistencia, color, presencia de moco y sangre, etc. y en algunos casos se puede hallar segmentos de gusano como proglótidos de tenias o parásitos enteros de ascáridos, etc.  COLOR Castaño claro u oscuro debido a los pigmentos, pudiendo variar al: Amarillo: Dieta láctea, o bilirrubina y no modificada. Verde: Vegetales ricos en clorofila calomelanos y bilirrubina Blanco: Acolia (ictericia obstructiva, grasas sin digerir, examen reciente con bario). Negro: Ingestión de hierro, bismuto carbón, presencia de sangre digerida (ver reacciones para investigaciones de sangre oculta). Rojo: Sangre sin digerir, betarraga y colorantes.  CONSISTENCIA Duras: coprolitos Normal: formadas o pastoso. Diarrea: semilíquidas o líquido (tres o más deposiciones diarias).  REACCIÓN: Normalmente las heces emitidas son de reacción ligeramente alcalina y con frecuencia neutra, la reacción ácida es menos frecuente y es debida generalmente a dieta vegetal. En los niños, las heces son corriente ácida. Examen 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.

Directo.-M étodo usado para materiales frescos y heces fijadas.Preparación de la muestra: Utilizar láminas limpias y desengrasadas. En cada extremo hacer preparaciones, con SF y la otra con lugol. Con un mondadientes o baqueta fina, colocar una pequeña cantidad de heces, en cada solución, homogenizando y extendiendo sin llegar a los bordes. Con cuidado colocar en ambos preparados un cubreobjetos limpio. La preparación debe quedar transparente. Observación de preparaciones en fresco. Colocar la preparación en la platina. Con el objetivo 10X y el tornillo macrométrico, enfocar la preparación. Graduar la intensidad de la luz, utilizando diafragma. Terminar el enfoque con el tornillo micrométrico. Se recomienda observar con los ojos abiertos, aún con el microscopio monocular, a fin de disminuir el cansancio.

Con suero fisiológico.Utiliza una solución isotónica. Este método es importante para el estudio de parásitos vivos, especialmente trofozoítos de protozoarios y larvas de helmintos. La falta de coloración no permite la observación de los caracteres morfológicos diferenciales. Con Lugol.Utiliza una solución yodo yodurada. Semejante al método anterior, es útil para quistes de protozoarios y huevos de helmintos, mata a las larvas y trofozoítos, la ventaja está en la coloración de los parásitos.

Métodos de concentración TÉCNICA DE SEDIMENTACIÓN ESPONTÁNEA EN TUBO (TSET) Procedimiento 1- Se toma de 2 a 5 g. de heces 2- Se homogeniza en 10 ml. de solución salina o agua destilada. 3- Se filtra a través de gasa 4- La mezcla obtenida se coloca en un tubo cónico de plástico de 13 x 2.5 cm y 50 ml de capacidad (puede variar). 5- Se completa el volumen final del tubo con solución salina o agua destilada y se tapa en forma hermética. 6- Se agita enérgicamente por 30 segundos y se deja reposar por 45 minutos. Se elimina el sobrenadante 7- Con una pipeta se toma una gota del fondo del tubo. 8- La gota se coloca en una lámina portaobjeto, con lugol se cubre con una laminilla de 22x22 mm. 9- Se observa al microscopio a (10X y 40X). Por Flotación.Estas técnicas utilizan sustancias químicas de mayor densidad que los quistes y huevos de parásitos. Los métodos más conocidos son: La técnica de Faust y Willis. Willis.1. Utiliza como solución más densa (1.200), solución hipertónica de cloruro de sodio, la cual puede reemplazarse por sal de cocina. Se mezcla 1 gramo de heces con 10 a 20 ml de la solución salina todo lo cual se coloca en un tubo de ensayo y se completa con la solución salina hasta hacer un menisco en le borde. Se cubre el tubo con una laminilla por 15 minutos y luego se le coloca en una lamina portaobjeto para ser observada. Esta técnica permite observar quistes y huevos. Por Centrifugación.Se basa en el uso de sustancias de menor densidad a la de los quistes y huevos. Existen varios m étodos: Ritchie, Telleman. MÉTODO DE RITCHIE.1. Se mezcla 1 g. de heces con 10 mL de solución salina en un tubo. 2. Centrifugar a 1500 rpm por 2 minutos y decantar (3 veces). 3. Se agrega 10 mL. de formol al 10% 4. Se agrega 3 mL. de éter sulfúrico y se agita. 5. Centrifugar 2 min. a 1500 rpm. 6. Se rompe tapón de detritus y se decanta. 7. Se toma una gota del sedimento y se prepara el examen directo con lugol. TÉCNICA DE FAUST.En un primer momento se filtran las materias fecales a través de gasa con agua destilada, se coloca en un tubo de centrífuga, se centrífuga y al sedimento se agrega sulfato de zinc al 33% ( densidad 1.180); se homogeniza y se vuelve a centrifugar hasta que pare sin freno y luego se coloca el tubo en una gradilla, se completa con sulfato de zinc el contenido del tubo hasta formar un menisco en la boca del tubo, se coloca una laminilla cubreobjeto sobre ella y se deja por 10 minutos y luego se le retira y se le coloca sobre un portaobjetos para observarse al microscopio.

MÉTODO DE CORTICELLI Y LAI En una placa de 10 cm. de diámetro, colocar 10 g. de heces aprox. Depositar esta placa en otra placa de 5 cm. de diámetro a la que se agrega agua corriente hasta una altura de 0.5 cm. y tapar, disponiéndose de una cámara húmeda. Incubar a 25-27 °C, destapar diariamente para su oxigenación y reponiendo el agua que se hubiera evaporado. Transcurrido un lapso de tiempo (para huevos tipo Strongylus es de 10 a 12 días y para Nematodirus y Lamanema es de 3 a 4 semanas). MÉTODO CUANTITATIVO DE DIAGNÓSTICO Recuento de huevos de helmintos: Los métodos cuantitativos tienen como finalidad determinar el grado de infección por helmintos y se basa en el recuento de huevos en heces recientemente emitidas. Sirve para evaluar antihelmínticos. Los métodos más frecuentes son el de Stoll y el de Kato-Katz, se les utiliza en casos de Uncinariosis, Trichuriosis y Ascariosis. MÉTODO DE STOLL: Fundamento: Se basa en la relación que existe en forma aproximadamente constante entre el número de huevos y el número de parásitos adultos. Se coloca 4 g. de heces en un frasco de 200 mL, se agregar 56 cc de hidróxido de sodio 0.1N se agitar la mezcla y dejar reposar durante 24 horas, agitar la mezcla y destapar. Se retira con la pipeta 0.15 mL del centro del líquido y se coloca en 2 gotas separadas en la lámina portaobjetos, colocar 2 cubreobjetos. - Colocar la lámina al microscopio y recorre la lámina en sentido horizontal o vertical desde uno de los ángulos, contar cuidadosamente el número de huevos de las dos preparaciones. - Multiplicar el número obtenido por 100. - El resultado es la cantidad de huevos por gramo de heces. Esta cifra se multiplica por el peso total de la muestra obtenida con lo que se obtiene el número de huevos por día. Luego esta cantidad se multiplica por 2 considerando ambos sexos de helmintos. - Finalmente, se multiplica por el factor de la muestra: 1 1.5 2 3 3

: : : : :

Heces formadas. Heces levemente formadas. Heces semiblandas o pastosas. Heces blandas o levemente diarreicas. Heces líquidas.

Se calcula el total de parásitos dividiendo el total de huevos por día obtenidos en el cálculo anterior, entre la oviposición conocida de cada especie: - Uncinarias pone 8,500 a 9,000 huevos por día. - Trichuris hembra pone 3,000 a 5,000 huevos por día. - Ascaris hembra pone 72,000 a 250,000 huevos por día - Fasciola pone 25,000 huevos por día. Por ejemplo: Al hacer recuento de las 2 laminillas se obtuvo 20 huevos x 100 (factor)=2000 huevos por g. de heces los que se multiplican por 250 g. (cantidad de muestra de heces)= 500,000 huevos por día x 2 (sexo) = 1*000,000 y por último multiplicar por el factor de la muestra que es en este caso 2 (pastosas o semiblandas). 1'000,000 x 2 = 2'000,000 de huevos por día. Si corresponde Ascaris: 2'000,000 / 250,000 =

8 ejemplares.

Si corresponde a Trichuris 2'000:000 / 5,000 = 400 ejemplares.

MÉTODO DE KATO KATZ: Se recomienda para las helmintiasis, se diferencia de Stoll en que no se pesan las heces sino que se mide un volumen determinado por el kit preparado para el método. 1. 2.

Material: M uestra de heces. Kit de Kato Katz, Tela de nylon de malla fina, Lámina de plástico rectangular con orificio central de 6 mm de diámetro y 1.37 mm de profundidad. Espátula, Celofán remojado en verde de malaquita, Lámina portaobjetos, alcohol 50%, algodón, lejía. Microscopio con objetivos de 10 y 40 X.

Procedimiento: 1. En una lámina portaobjetos colocar la tela de nylon y filtrar las heces, aplastándolas con la ayuda de la espátula. La malla retiene el detritus grueso y deja pasar heces. 2. En otra lámina portaobjetos poner la placa de plástico con el orificio. 3. Con la espátula recoger las heces filtradas y colocarlas en el orificio de la lámina de plástico rectangular. 4. Comprimir las heces hasta que llenen el orificio sobre la lámina portaobjetos. 5. Descartar la malla y retirar la lámina perforada a la solución de lejía, sólo quedarán las heces sobre la lámina. 6. Colocar el celofán coloreado en verde de malaquita sobre la muestra de heces y presionar hasta que se distribuya la muestra de manera uniforme sobre la lámina. 7. Dejar reposar de 30 a 60 minutos. 8. Observar al microscopio con objetivos de 10 y 40 X, recorrer toda la lámina empezando en un ángulo y contando los huevos que se encuentran. 9. Luego de terminar el recuento, multiplicar el número de huevos por 23 ó 24, lo cual corresponde al número de huevos por gramo de heces. 10. Con ayuda de la tabla anexa determine el N° total de huevos por gramo de heces. MÉTODO DE MIGRACIÓN LARVARIA O DE BAERMANN Se utiliza para obtener estados larvarios de nematodos presentes en heces y secreciones. Este método se basa en la capacidad que tienen las larvas de migrar dentro de un sustrato líquido o semilíquido, por lo cual sedimentan al fondo del recipiente que las contiene. Material: -Embudo de 7 a 10 cm de diámetro. -Tubo de ensaye -M anguera de hule latex -Gasa. -Caja de Petri -M icroscopio. Técnica: -Se une el tubo de ensaye al embudo a través de un pedazo de manguera de latex. -Se añade agua al embudo entre los 20 y 25 °C. -Diez gramos de heces se envuelven en la gasa, la cual se coloca en el interior del embudo. -La muestra debe de permanecer en el agua entre 6 y 24 horas para permitir la migración larvaria. -Pasado el tiempo necesario se pinza el tubo de latex y se retira el tubo de ensaye. -Su contenido se vacia en una caja de Petri y se hace el conteo larvario.

MÉTODO DE MC MASTER Se utiliza para detectar y cuantificar ooquistes y huevos por gramo de materia fecal. Se coloca solución saturada de NaCl a la probeta del equipo, son 28ml de solución más 2gr de heces medidos por el desplazamiento de 2 ml que hacen un volumen total de 30ml. Los compartimentos delimitados de la cámara miden 1cm cuadrado, cada compartimento tiene seis divisiones. El fondo de la cámara mide 1.5 mm por cada lado que dan un total al sumar de .30 ml. El resultado se expresa como: Numero de huevos por gramo de heces (HPG). Material: -Equipo de M c Master (cámara y probeta) -Solución saturada de NaCl -Coladera de malla fina -Cucharas -Goteros o pipetas -M icroscopio Técnica: -Se llena la probeta con solución NaCl hasta la marca de 28 ml. Y se agregan los 2 gr. de heces medidos por desplazamiento de 2 ml. -Se tapa la probeta, se homogeniza y se pasa a través de la coladera. -Se toma con el gotero la cantidad suficiente para llenar los compartimentos de la cámara. -Se deja reposar la cámara por cinco minutos para permitir el ascenso de los huevos. -Se observa al microscopio con el objetivo 10x. -Se hace la conversión para obtener el resultado de número de huevos por gramo de heces.

HARADA –MORI En investigaciones para estudiar la distribución regional o geográfica de las uncinarias de humanos Necator americanus y Ancylostoma duodenale; para la diferenciación entre larvas de uncinarias del humano y de los «huevos parecidos a los de uncinarias del humano» (Trichostrongylus, Ternidens, Strongyloides fülleborni); en la diferenciación entre larvas de uncinarias y otras larvas; para determinar la viabilidad de los huevos y/o larvas en estudios sobre efectividad anti-helmíntica; para estadios similares en parasitología veterinaria. Muestra requerida Heces frescas, sin refrigerar, recolectadas en frasco (vidrio, plástico o cartón) limpio, de boca ancha, con tapadera, debidamente identificado, sin contaminación. Materiales Tubos de ensayo de preferencia cónica, de 15 mL de capacidad, en su defecto, tubos de ensayo de 25 X 175 mm Tiras de papel filtro (Whatman #2 u otro similar) cortadas 2 mm menos anchas que el diámetro del tubo y 2 cm más largas, con un extremo más afinado. Agua destilada, en una pizeta Bajalenguas, palos de paleta o aplicadores de madera Gradilla o soporte para tubos Guantes Lente de aumento o lupa de mano (opcional) Pipetas Pasteur. METODO: 1.- Se extiende una fina película de heces (de 1 a 2 mm) en un lado del tercio medio de una tira de papel filtro. 2.- Se coloca el papel en un tubo de ensayo con 3 ml de agua destilada forzando la tira hasta aproximadamente el nivel de 1 cm y presionando el lado limpio contra la pared del tubo.

3.- Se conserva el cultivo a temperatura ambiente (24-28°C) en la oscuridad durante un periodo de 1-5 días añadiendo agua según se vaya necesitando para mantener el nivel bastante por encima del extremo inferior del papel filtro. El flujo capilar del agua que sube a través del papel y la película fecal mantiene húmedas las heces y transporta sus elementos solubles hacia la parte superior del papel, donde se evaporan o acumulan en un depósito oscuro. Al alcanzar la fase infecciosa, las larvas migran hacia abajo contra la corriente del flujo del agua, y al alcanzar el nivel de ésta se sumergen hacia el fondo, donde pueden verse con una lupa y tomarse con una pipeta para su examen microscópico. La tira de papel filtro puede transferirse a un tubo limpio lleno de agua para recoger las larvas que hayan podido quedar en la película fecal. Algunas especies de larvas tienen tendencia a no migrar hacia abajo. Antes de retirarlas, las larvas pueden inmovilizarse introduciendo el tubo a baño M aría (50-60°C) o añadiendo una cantidad de ácido Acético al 20%.

TABLA PARA EL CÁLCULO DEL NÚMERO TOTAL DE HUEVOS/ g. DE HECES (Método de Kato-katz) N°huevos

N°

N°hue

N°

N°hue

N°

N°huevo

N° huevos

encontrados

P /g.de

encont

p/ g.De

encont

p/ g.de

encontra

p/g.de

Por lámina

heces

por

Heces

Por

heces

por

heces

1

24

26

624

51

1224

76

1824

2

48

27

648

52

1248

77

1848

3

72

28

672

53

1272

78

4872

4

96

29

696

54

1296

79

1896

5 6

120 144

30 31

720 744

55 56

1320 1344

80 81

1920 1944

7

168

32

768

57

1368

82

1968

8

192

33

492

58

1392

83

1992

9

216

34

816

59

1416

84

2016

10

240

35

840

60

1440

85

2040

11

264

36

864

61

1464

86

2064

12

288

37

888

62

1488

87

2088

13

312

38

912

63

1512

88

2112

14

336

39

936

64

1536

89

2136

15

360

40

960

65

1560

90

2160

16

384

41

984

66

1584

91

2184

17

408

42

1008

67

1608

92

2208

18

432