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PRACTICA No 3 DEGRADACIÓN DE AMINOÁCIDOS: TRANSAMINACIÓN TRANSAMINACION EN PRESENCIA DE UN PREPARADO DE HIGADO DE PALOMA . Expresión de Resultados:

Manchas Sistema 1

Sistema 2

Sistema 3

Sistema 4

Rf 1

27

2

56

3

27

4

56

5

12

6

27

7

12

Estándar de Alanina

55

Estándar de Glutamato

27

Estándar de aspartato

12

Haga la identificación de cada una de las manchas señalando a qué aminoácido corresponde en base a sus valores de Rf. Tenga en cuenta que los valores de Rf para los aminoácidos: Alanina, ac. glutámico y ac. Aspártico son de 58, 26 y 11.2 respectivamente, para el solvente usado en la presente cromatografía. Manchas Sistema 1 Sistema 2 Sistema 3 Sistema 4

Aminoácido GLUTAMATO ALANINA GLUTAMATO ALANINA ASPARTATO GLUTAMATO ASPARTATO

1 2 3 4 5 6 7

INTERROGANTES BIOQUIMICAS 1. Que es Rf : Distancia que recorre la muestra desde el punto de aplicación / distancia que recorre el disolvente hasta el frente del eluyente

Sistema 1:Hay una transaminación por que se encuentra el glutamato y la alanina Sistema 2: hay una transaminación de la alanina y alfa cetoglutarato ya que el piruvato se convierte en alanina. Sistema 3: se encuentra una mancha de aspartato y glutamato Sistema 4:se ve que hay una desnaturalización

2. Cuales son las reacciones catalizadas por TGO y TGP TTGP

Alanina + α- cetoglutarato

piruvato +glutamato TTGO

Aspartato + α- cetoglutarato

oxalacetato + glutamato

3. Que papel desempeña el piridoxal fosfato en las reacciones de transaminación ?. Cuál es el grupo funcional del cofactor ?. Explique su mecanismo 

Actúa como cofactor de todas las reacciones de transaminación que es transportador del grupo amino (B6)



En la primera etapa de la transaminación el cofactor enzimático (B6) es el primer acoplador del grupo amino.

4. Cuál es el objeto del sistema 2 

Observar la reacción reversible con la enzima TGP



Formación de la Alanina

5. Explique el mecanismo que permite la separación de sustancias por cromatografía en capa fina 

La fase móvil contiene varios disolventes la fase estacionaria es la silica gel que se usa para separar sustancias más polares (alcoholes, aminas, ácidos y otros).

6. Se desprende amoniaco libre en el medio durante una reacción de transaminación ?. Fundamente su respuesta 

Cuando se desamina el glutamato forma el α- cetoglutarato, pero el amino que pierde puede ingresar al ciclo de la urea.

7. Pronostique el efecto de una deficiencia de vitamina B6 sobre la degradación de los aminoácidos. La degradación de los 20 aminoácidos sería afectada ?. 

Afectaría la degradación de aminoácidos, ya que la enzima TGP y TGO usan como cofactor a la vitamina B6.

8. Cuál será la distribución celular de la TGO y TGP ?



TGO: Presente en isoenzimas citosólicos y mitocondriales del hígado, musculo esquelético y cardiaco, riño, páncreas, pulmones, leucocitos, y glóbulos rojos



TGP: Presente en enzima citosolica que se encuentra en altas concentraciones en el hígado.

9. Si en el experimento de transaminación que Ud. realiza colocará ácido pirúvico uniformemente marcado con C14, Qué aminoácidos espera encontrar marcados preferentemente ?. Fundamente. 

Se encontraría marcado el glutamato ya que es el segundo compuesto que resulta de la alanina + α- cetoglutarato y como es reversible también encontraremos alanina marcada.

10.

Si se administra glucosa con C14 a un animal, los carbonos marcados se

incorporaran en una proteína. Señale algunas secuencias de reacciones que permitan explicar este fenómeno. 

La glucosa parte del ácido piruvico no dirigido por lo tanto, la insulina que se encuentra en exceso pasa a la sangre.

11.

Participan las reacciones de transaminación en la biosíntesis de aminoácidos ? 

Si, ya que es la transferencia de un grupo amino desde un aminoácido donador a un cetoacido.

12.

Que pensaría de un ensayo en el cual una muestra biológica como el suero se

mezclara

con

aspartato, alfa-cetoglutarato, NADH y

un

exceso de malato

deshidrogenasa ?. Que idearía para determinar la actividad de TGP por un método similar ?. 

Que el Aspartato cataliza la transferencia del grupo amino desde el L –aspartato a la α- cetoglutarato dando oxalacetato y el L-glutamato.

13.

Si se utilizara leucina y -ceto glutarato para estudiar la transaminación; qué

productos se podría identificar?. Qué nombre propondría para la enzima involucrada?



14.

Leucina + α- cetogluta

Aminoácido transferasa

cetometilbutarato + glutamato

Es factible la identificación de cetoácidos mediante cromatografía?. De qué manera? 

Nos permite identificar si hay cetoácidos, si los Rf corresponden al estándar.

EXPERIMENTO 2 DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD DE ALANINA AMINO TRANSFERASA (TGP) EN SUERO SANGUINEO Absorbancias 1 Muestra

0.400

0.345

0.330

2 Muestra

0.011

0.013

0.008



SISTEMA 1



1min 0.400 – 0.345 = 0.055 Promedio 0.035



2min 0.345 – 0.330 =0.015 0.035 x 1750 = 61.25 U/L



SISTEMA 2



1min 0.011 – 0.013 = 0.002 Promedio 0.035



2min 0.013 – 0.008 =0.005 0.035 x 1750 = 61.25 U/L Resultados 1 Muestra U/L

61.25

2 Muestra U/L

61.25



Muestra 1 esta elevada relacionándose con daño cardiaco



Muestra 2 el daño es cardiaco al igual que el primero

Interrogantes Bioquímicas. 1.- Escriba las reacciones catalizadas por la TGP y TGO. 



2.- Qué papel desempeña el piridoxal fosfato en las reacciones de transaminación. Explique su mecanismo de acción. 

Las amino transferasa necesitan el cofactor enzimático piridoxal fosfato, contiene aldehído que traslada al grupo amino.

3.- Se desprende amoniaco libre en el medio durante las reacciones de transaminación? Fundamente su respuesta. 

El glutamato es el producto común, cuando se desamina y forma el α – cetoglutarato pero cuando pierde ingresa al ciclo de la urea.

4.- De qué manera es de utilidad la determinación de la actividad TGP en el diagnóstico de la deficiencia de piridoxina? Si en un paciente se encuentra disminuida la actividad TGP

del suero, es suficiente este dato para diagnosticarlo como deficiente en piridoxina?. Por qué? 

Participa en el metabolismo de aminoácidos en la transaminación donde se utiliza piridoxal fosfato como grupo prostético.



Si es suficiente el dato para un diagnóstico de deficiencia en piridoxina el TGP es específico del hígado y se encuentra en concentraciones elevadas.

5.- Se hace referencia de que en el hepatocito TGP es una enzima, exclusivamente citosólica. Está Ud. de acuerdo con esta afirmación? ¿Cuál sería la distribución intracelular de la TGO? Fundamente su respuesta. 

TGP: Es una enzima citosolica, que se encuentra en altas concentraciones en el hígado.



TGO: Está presente en las isoenzimas citosolica y mitocondriales.

6.- Si en el experimento de transaminación que Ud. ha realizado, colocara ácido pirúvico uniformemente marcado con C-14. ¿Qué aminoácidos esperaría encontrar marcados preferentemente? Fundamente su respuesta. 

Se encuentra marcado el glutamato ya que es el segundo compuesto que resulta de la alanina + α- cetoglutarato y como es una reacción reversible también podríamos encontrar alanina marcada.

7.- Si se administra glucosa C-14 a un animal de laboratorio, los carbonos marcados se incorporarán en una proteína? Señale la secuencia de reacciones que permita explicar este proceso. 

El ácido piruvico no degrado forma glucosa, por lo tanto la insulina pasa ala sangre

8.- Participan las reacciones transaminación en la biosíntesis de aminoácidos? Cite algunos ejemplos. 15.

Cuales son las reacciones catalizadas por TGO y TGP

Si participan : 

TTGP

Alanina + α- cetoglutarato

piruvato +glutamato TTGO



Aspartato + α- cetoglutarato

oxalacetato + glutamato

9.- Qué otro método, además del que se usó en esta práctica, podría emplear para detectar los productos de la reacción de transaminación.



HPLC



Cromatografía en capa fina



Espectrofotometría

10.- Qué pensaría de un ensayo en el cual una muestra de suero es mezclada con aspartato, alfa ceto glutarato, NADH y un exceso de malato deshidrogenasa? Cuál sería su fundamento? La actividad de qué enzima se estaría midiendo? TTGO



Aspartato + α- cetoglutarato



NADH + α- cetoglutarato

oxalacetato + glutamato DESHIDROGENASA

malato + NAD...