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PRÁCTICA #2: “Material de Laboratorio: Lavado y Esterilización”

UNIVERSIDAD VERACRUZANA CAMPUS COATZACOALCOS FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

REPORTE DE PRÁCTICA No. 2

MATERIAL DE LABORATORIO: LAVADO Y ESTERILIZACIÓN Académico: Dra. Cuevas Díaz María del Carmen

Integrantes del Equipo No. 3: De la Cruz López Paola Sabrina (S19016561) Méndez León María Mercedes (S19016534) Ríos Alejandro Nicthe (S19016539) Sura Jiménez Melanie (S19016527) Trinidad Concepción Luis Raúl (S19016533) Grupo y Carrera: IA-401 Periodo lectivo: 2020-2021 Fecha: 15/febrero/2021

PRÁCTICA #2: “Material de Laboratorio: Lavado y Esterilización”

REPORTE DE PRÁCTICA Competencia Aplicará la técnica de esterilización y selección de agente de control para el control de la contaminación microbiológica en el laboratorio utilizando el material y equipo adecuado.

Introducción La esterilización es el proceso mediante el cual se alcanza la muerte de todas las formas de vida microbianas, incluyendo bacterias y sus formas esporuladas altamente resistentes, hongos y sus esporos, y virus. Se entiende por muerte a la pérdida irreversible de la capacidad reproductiva del microorganismo, pérdida de su vitalidad. Los procesos de esterilización y/o desinfección son diariamente llevados a cabo, no solamente en el laboratorio; donde son fundamentales para evitar la contaminación de medios, cultivos, placas etc., sino también en otros ámbitos tales como los hospitales, donde fallas en estos procedimientos aumentan la morbimortalidad de los pacientes. (VIGNOLI, 2002) Gracias a la existencia de estos procedimientos el ser humano ha podido avanzar más en sus descubrimientos y aportaciones tanto en la microbiología médica como en la microbiología general. Existen diversos métodos de esterilización, en este caso, refiriéndonos al autoclave, el cual es el principal método de esterilización que emplea calor húmedo, esterilización por vapor a presión. El calor húmedo destruye los microorganismos por coagulación de sus proteínas celulares. Existen también otros métodos de descontaminación que emplean este tipo de calor los cuales, aunque no permiten la destrucción total de los microorganismos, disminuyen la carga microbiana que posee un material. Entre estos métodos podemos citar: Tindalización (esterilización fraccionada), Agua hirviendo, Pasteurización, Olla de presión.

Resumen El material y equipo utilizado en el laboratorio de Microbiología varía según el trabajo que se desarrolle. El material para siembra se encuentra constituido por asas y filamentos de platino, asas de Drigalski y pipetas estériles. Para esterilizar se utilizan equipos como el autoclave (calor húmedo), hornos (calor seco), mechero (esterilización directa). Para incubar estufas y baños de agua o arena. Para observar se utiliza el microscopio. Para limitar o eliminar a los microorganismos de materiales y medios de cultivo se procede a desinfectar o esterilizar. La esterilización elimina totalmente a los microorganismos, mientras que en el proceso de desinfección se eliminan las formas vegetativas. La esterilización puede ser seca o húmeda. En calor seco los microorganismos son destruidos mediante oxidación y las enzimas por su origen proteico se desnaturalizan. Se utiliza para esterilizar asas y material de vidrio (150 a 180 °C durante 2 h). En la esterilización con calor húmedo se utiliza el vapor de agua y la presión para alcanzar temperaturas de 121 °C. Generalmente se emplea autoclave a una presión de 15 lb/in2 durante 15 minutos. Como control de calidad que permita determinar la eficiencia de la esterilización se emplea Bacillus stearothermophilus, por ser sus esporas resistentes a este proceso. La esterilización en autoclave o en olla de presión debe basarse en los estándares de esterilización (cuadro 1.1).

PRÁCTICA #2: “Material de Laboratorio: Lavado y Esterilización”

Cuadro 1.1 Parámetros de esterilización

Calor húmedo a presión de 15 a 30 psi (lb/in2) Temperatura (°C)

Tiempo para eliminar

Calor seco Temperatura (°C)

esporas (min)

Tiempo para eliminar esporas (min)

116

30

121

6

118

18

140

3

121

12

150

2.5

125

8

160

2

132

2

170

1

138

0.8

180

0.5

ISEM, 2005 Si se tienen materiales sensibles al calor como vitaminas o aminoácidos se puede utilizar el método de filtración en donde se utilizan membranas estériles de 0.2 µ de diámetro. Para limpieza de superficies o inclusive algún material se pueden utilizar algunos productos químicos Se clasifican según su afectividad y según el lugar donde pueden ser utilizados: • Agentes antisépticos. Estos agentes son capaces de destruir microorganismos al contacto. La eficiencia de los antisépticos depende de la concentración, temperatura y tiempo de exposición (Gennaro et al, 2003). • Agentes desinfectantes. Acción de los agentes desinfectantes dependerá de una serie de factores como tipo de bacteria, temperatura, pH, cantidad de bacterias presentes, edad de las bacterias, tiempo de exposición y concentración del desinfectante (Raspall, 2006). Solo se emplean en ambientes objetos en medios inertes, algunos son tóxicos con capacidad de destruir tejidos vivos (Negroni, 2009). • Agentes esterilizantes. Internacionalmente los microorganismos se clasifican en cuatro grupos según biopeligrosidad. La OMS no tienen una lista oficial y recomienda que cada país o área grafica elabore la suya propia. Los fenoles y compuestos cuaternarios de amonio son adecuados para la limpieza de superficies, pero causan corrosión. Se recomienda la utilización de hipoclorito de sodio al 1%. Los factores que influyen en la acción química de los desinfectantes son los siguientes: • Limpieza adecuada • Carga orgánica (sangre, mucosa, tejidos, etc.) • Tipo y porcentaje de microorganismos. Si existen 1 x 101 organismos, esto representa 10 de ellos, por lo que el desinfectante debe ser capaz de lidiar con la cantidad existente de microorganismos. • Tiempo y temperatura • pH • Nivel de la dureza del agua. Debido que los minerales como el calcio y magnesio puede afectar eficiencia al estar en contacto con los ingredientes activos del desinfectante.

PRÁCTICA #2: “Material de Laboratorio: Lavado y Esterilización”

Cuestionario 1- Dibuje y describa las características de los equipos utilizados en el laboratorio de microbiología. 1.1. Mesas de laboratorio y fregadero

1.2. Vitrinas y armarios

1.3. Mechero Bunsen

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Todas las manipulaciones deben realizarse en un radio de 10-15cm de la llama del mechero (zona aséptica). En caso de utilizar mechero nunca se debe coger material por encima de la llama. Antes de comenzar a trabajar se procurará disponer de todo el material necesario para el procesamiento de la muestra. Tomar las medidas

necesarias para evitar la contaminación de las muestras o/ y cultivo por microorganismos ambientales 1.4. Gradillas

1.5. Estufa de incubación Es una cámara de temperatura controlada para cultivo de microorganismos. Se utiliza para facilitar el desarrollo de los microorganismos a su temperatura óptima de crecimiento (generalmente 35-37º).

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1.6. Frigorífico o cámaras refrigeradas Se utilizan para conservar tanto materiales (medios de cultivo, reactivos) como microorganismos. Generalmente están a una temperatura fija de 4ºC.

1.7. Congeladores Se utilizan para la conservación de reactivos y microorganismos a temperaturas inferiores a 0ºC, llegando a -80ºC (los más frecuentes son -20º, -40º y -80º).

1.8. Microscopio óptico

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1.9. Centrífuga Aparato que aplica sobre los tubos una fuerza centrífuga lo que permite la separación de los distintos componentes de la muestra mediante la precipitación en el fondo del tubo de las partículas en suspensión.

1.10. Cámaras de seguridad biológica

1.11. Desionizador de agua La mayor parte de los trabajos que se realizan en un laboratorio de Microbiología Clínica necesitan la utilización de agua pura con el fin de evitar cualquier tipo de interferencia. Entre otra característica debe: estar exenta de materiales en suspensión o un pH comprendido entre 5,0 y 7,5. Durante años se ha utilizado agua destilada, en la actualidad los destiladores se han ido abandonando para dar paso a desionizadores que funcionan con resinas de intercambio iónico. También se pueden utilizar otras técnicas como la ósmosis inversa.

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1.12. Contador de colonias Es un aparato que mediante la iluminación de la placa y una lupa, nos permite observar con mayor nitidez las colonias y por tanto facilita su recuento.

1.13. Balanzas

1.14. Baños termostáticos son recipientes que contienen agua y un sistema de regulación de la temperatura. Se utilizan para atemperar medios de cultivo o incluso para incubar cultivos de microorganismos.

1.15. Agitador/ mezclador

vortex

agitador horizontal

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1.16. Jarras de anaerobios

Recipientes que se usan para conseguir una atmósfera libre de oxígeno para el cultivo de microorganismos anaerobios.

1.17. Asas de siembra

Se utilizan para sembrar. Pueden ser metálicas o de plástico, curvas o rectas (para la siembra por picadura).

1.18. Ph-metros:

1.19. Material fungible Placas de Petri: recipientes para la preparación de medios de cultivo sólidos

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Placas de Petri con medio sólido

Tubos con medio líquido

Tubos con medio sólido

Pipetas de vidrio, de plástico y pipeteadores

Pipetas

Pipeteador automático

Pipeteador manual

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Pipetas automáticas (micropipetas) y puntas de pipeta: Se utilizan para pipetear pequeñas cantidades de líquidos. Se utilizan con puntas desechables de distinto tamaño y color según la micropipeta. Existen cuatro tamaños: de 0,5-2µm; de 2-20 µm; de 20-200 µm y de 200-1000 µm.

Asas acodadas o Asas de Digralsky: Se utilizan para la extensión de microorganismos sobre la superficie de un medio de cultivo en placa Petri.

Portas y cubres Para realizar las observaciones al microscopio.

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Vasos de precipitados y matraces

Cucharas y espátulas: Se utilizan para pesar muestras o medios de cultivo.

2- ¿Por qué el material de vidrio debe estar limpio previo a su uso? Porque al momento de utilizarlo si no está limpio la grasa y otros materiales contaminantes impiden que se pueda humedecer el vidrio de forma uniforme. A su vez, esto altera el volumen de residuo que se adhiere a las paredes del recipiente de vidrio y, por lo tanto, afecta el volumen del líquido medido o suministrado. Además, en el caso de las pipetas y buretas, se distorsiona el menisco y no se pueden realizar los ajustes correctos. Es posible que la presencia de pequeñas cantidades de impurezas también altere el menisco. 3- ¿Cuál es el mecanismo por el cual el vapor saturado alcanza a eliminar los microorganismos?

Las autoclaves de vapor están diseñadas para el uso de vapor de alta presión y temperatura para matar microorganismos. También se utilizan para inactivar materiales biopeligrosos. Para que la autoclave de vapor sea efectivo, los materiales a esterilizar deben estar saturados de vapor. Si no hay suficiente vapor o bolsas de aire en los materiales, la descontaminación no tendrá lugar. 4- ¿Cuáles son los métodos más utilizados para esterilizar? • Calor húmedo (en autoclave de vapor) • Calor seco (en horno de esterilización) • Flama directa • Incineración • Aire caliente • Ebullición • Vapor

PRÁCTICA #2: “Material de Laboratorio: Lavado y Esterilización”

• • • •

Tindalización Radiación Radiación ionizante Radiación no ionizante

5- ¿Qué tipo de material se puede esterilizar en el horno seco? • Se puede esterilizar: • Aluminios. • Vidrios. • Porcelanas. • Metales (acero inoxidable, niquelados, cromados). • Polvos. • Vaselina. • Parafina. • Aceites. • Otras sustancias grasas. 6- ¿Cuál es la temperatura y tiempo que se requiere para alcanzar la esterilización en el horno seco? Tiempo de esterilización es de 1 h a 170 °C o de 2 h a 160 °C. ya que las bacterias son más resistentes al calor seco que al calor húmedo. 7- ¿A qué se denomina pasteurización? El proceso de pasteurización fue llamado así luego que Luis Pasteur descubriera que organismos contaminantes productores de la enfermedad de los vinos podían ser eliminados aplicando temperatura. Luego se empleó a otros productos para lograr su conservación. 8- ¿Cómo se verificaría que un medio de cultivo procesado en la autoclave quedó realmente esterilizado? Para que la esterilización sea eficaz, la temperatura y el tiempo seleccionados deben alcanzarse en todo el líquido. Por ese motivo, no conviene esterilizar juntos recipientes grandes y pequeños, sino seleccionando el volumen del instrumental. Por otro lado, los recipientes con cierre hermético deben introducirse en la autoclave sin cerrar totalmente el tapón, para facilitar la entrada del vapor durante el proceso. Por último, otra indicación a tener en cuenta es que los recipientes vacíos precisan de un tiempo de esterilización mayor que los recipientes con líquido en su interior.

PRÁCTICA #2: “Material de Laboratorio: Lavado y Esterilización”

Diagrama de Procedimiento de la Técnica a) Lavado 1.- Lavar las cajas de Petri, pipetas, matraces con detergente biodegradable y enjuagar con abundante agua. Posteriormente enjuagar con agua destilada con una piceta y dejar escurrir, colocando sobre papel de envoltura. 2.- Envolver las cajas de Petri y las pipetas con papel estraza. Las puntas para micropipetas, si no están estériles colocarlas en un vaso de precipitados y tapar con papel aluminio. 3.- Elaborar tapones de algodón cubriendo con gasa. Deben quedar holgados para tapar tubos y matraces. Cubrir con capucha de papel estraza o de aluminio. b) Esterilización 4.- Colocar las cajas de Petri y las pipetas en el horno a 150 °C durante 2 h. Sacarlas, dejarlas enfriar y únicamente abrir en la campana con los mecheros. 5.- Esterilizar los tubos en autoclave como lo indica la figura 2.1:

1. Reconozca las partes del autoclave

2. Asegurar el nivel de agua del autoclave, sino agregar al nivel indicado

3. Colocar el material identificado con cinta testigo o medio y cerrar las valvulas. Debe quedar herméticamente cerrado

6. Contar el tiempo de esterilización una vez alcanzada la temperatura ( 15 minutos)

7. Purgar el autoclave. Se observa si la válvula de salida es una mezcla vapor -aire hasta que sólo salga flujo continuo de vapor

5. Cerrar la válvula de salida .Observar el manómetro que adquiera una presión y temperatura de esterilización (121°C y 15 lb/pulgada2)

8. Al terminar el ciclo de esterilización, apagar equipo y dejar el autoclave se enfríe hasta la presión indique en cero

4. Abrir la válvula de salida de vapor y encender el autoclave

9. Abrir el autoclave y sacar el material

PRÁCTICA #2: “Material de Laboratorio: Lavado y Esterilización”

Esquemas y/o Imágenes

Nivel de agua

En la figura 2.2 se indican las partes del autoclave

Figura 2.3 Partes del autoclave vertical

PRÁCTICA #2: “Material de Laboratorio: Lavado y Esterilización”

Observaciones La autoclave es un recipiente de presión metálico de paredes gruesas con un cierre hermético que permite trabajar a alta presión para realizar una reacción industrial, una cocción o una esterilización con vapor de agua. Observaciones para el uso correcto de la autoclave en base al material multimedia proporcionado por la docente: •

Cuando coloquemos el material en la cámara se hará de forma ordenada, paquete sobre paquete y dejando espacios para que penetre el vapor.

•

Ya que hayamos colocado bien el material a esterilizar debemos asegurarnos de cerrar completamente bien la tapa del Autoclave, esto para evitar fugas y/o un mal funcionamiento del mismo.

•

Cuando el Autoclave esté funcionando siempre hay que estar pendiente de los manómetros, porque son ellos los que le indicarán lo que está sucediendo en cámara.

•

Por ningún motivo podemos dejar solo al Autoclave cuando esté funcionando, siempre hay que vigilar por cualquier problema.

•

Cuando termina el ciclo de esterilización a éste se le da un tiempo de pre secado, terminado este tiempo se abrirá la puerta, pero teniendo en cuenta que no se puede abrir en su totalidad si no dejarla semi abierta.

•

También tenemos que ver que el material no salga muy húmedo porque si no este se contamina muy fácil, tenemos que ver que éste salga completamente seco así no se contaminará.

Conclusión Como conclusión podemos decir que el lavado y la esterilización de los materiales, equipos, instrumentos de laboratorio es de suma importancia, pues si no hiciéramos la debida esterilización de los materiales antes y después de su uso, de nada servirían los proyectos o las investigaciones que estuviésemos realizando, ya que los resultados se verían afectados por la contaminación de las muestras, cultivos, instrumentos. Gracias al avance de la ciencia hoy en día no existe solo un método de esterilización, sino varios de ellos, todos cumpliendo de diferente manera un mismo propósito general, el avance en la microbiología, pues para poder estudiar correctamente a los microorganismos, bacterias, hongos, protistas, parásitos, virus, etc, la esterilización es algo básico que no debe faltar nunca.

PRÁCTICA #2: “Material de Laboratorio: Lavado y Esterilización”

Bibliografía Laboratorio Microbiología. (s. f.). Laboratorio Microbiología. Recuperado 17 de febrero de 2021, de http://campus.usal.es/%7Emicromed/Practicas_odontologia/unidades/labv/LabMicro/practica1.html

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