Propriétés physico-chimiques de l’ADN L1 SDV - S2 PDF

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Chapitre 1 BM...

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Biologie Moléculaire 2

17/01/2020

I/ Propriétés physico-chimiques de l’ADN Introduction → Une molécule d’ARN ne reste jamais simple brin car trop fragile, donc repliement de l’ARN en épingle à cheveux beaucoup plus résistante. → Génie génétique : toutes les manipulations in vitro effectuées sur l’ADN (nourriture aux propriétés intéressantes, protéines thérapeutiques, thérapie cellulaire/génique). → On s'intéressera aux gènes de l’ADN qui codent pour des protéines. Exemples : → Saumon de l’atlantique transgénique pour le gène de l’hormone de croissance Différentes modifications au niveau du génome ont été réalisées pour augmenter la quantité d’hormones de croissance afin de cultiver des saumons plus gros, plus rapidement et à toutes saisons de l’année. Changement de promoteur et de l’ADNc (introns enlevés) de l’hormone de croissance provenant de deux autres poissons. Promoteur : poisson vivant et résistant dans les eaux froides ADNc : poisson dont le gène pour l’hormone de croissance est super efficace → Souris transgénique Nagy Changement de l’expression d’une couleur avec un gène qui code pour la GFP, qui lui permet de fluorescer. Donc association du gène GFP avec un promoteur ubiquitaire/constitutif = gènes de ménage qui s’exprime dans toutes les cellules. → Clonage - Clonage reproductif : essayer d’obtenir un organisme à l’identique par multiplication asexuée (ex : Brebis Dolly) - Clonage naturel : multiplication végétative par bouturage - Clonage cellulaire : cellule à l’identique (procaryote et eucaryote unicellulaire) - Clonage moléculaire : amplification d’un fragment d’ADN par des microorganismes après son insertion dans un vecteur (avec plasmide, endonucléase, ligase…) → Thérapie génique (avec des cellules souches adultes) Une cellule souche a la capacité de se différencier en différents tissus. Les cellules cibles sont les lymphocytes, les fibroblastes, les cellules endothéliales, les kératinocytes, les hépatocytes, les myocytes, l’épithélium bronchique, et des cellules-souches médullaires. C’est une méthode consistant à introduire des acides nucléiques (ADN ou ARN) dans les cellules d’un organisme pour y corriger une anomalie, comme une mutation, à l’origine d’une pathologie. Les objectifs sont de : - corriger un déficit héréditaire - corriger un déficit génique acquis - programmer une cellule pour exprimer de nouvelles propriétés

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Un brin d’ADN est une succession de nucléotides : - Acide phosphorique - Sucre (désoxyribose) - Bases azotées (A, T, G, C) L’ADN est une double hélice, avec 2 brin d’ADN (bicaténaire) : - Orientation antiparallèle - Brins complémentaires : appariement A=T et G≡C (appariement entre une purine et une pyrimidine) Des lésions de l’ADN peuvent survenir. Par exemple, les UV créent d’autres liaisons entre deux thymine par liaisons covalentes (pontage). Si la lésion n’est pas réparée, elle est pérennisée, on parle alors de mutation pouvant conduire à des cancers de la peau par exemple. Il existe cependant des mécanismes de réparation dont les enzymes réparent le plupart des lésions de l’ADN. 1) Dénaturation/Renaturation de l’ADN La dénaturation permet de passer d’un ADN double brin = ADN natif à deux ADN simple brin = ADN dénaturé. On dénature par un augmentation de la température à 90°C ou en augmentant les valeurs du pH (jusqu’à un pH basique extrême avec de la soude NaOH). Soit on renature avec une baisse progressive de la température ou du pH, où l’ADN revient en double brin. Soit on met l’ADN dénaturé dans la glace, et les molécules ADN simple brin sont figées par le passage brutal de 90°C à 0°C. Ce qui permettra par la suite de faire différentes expériences. a) Température de fusion = Tm C’est la température à laquelle on atteint un point d’équilibre entre ADN double brin et ADN simple brin (50/50). Par l’élévation de température, la dénaturation commence par les endroits riches en A=T qui commence à s’ouvrir et devenir simple brin. Les dernières zones à se séparer sont celles riches en G≡C. C’est un mécanisme progressif où toutes les molécules sont dans le même état : à moitié ouverte côté A=T et à moitié fermée côté G≡C. La Tm dépend de la composition en A=T et G≡C de chaque molécule d’ADN. Quand la solution est chauffée, on parle d’effet hyperchrome. Quand la solution est refroidie, on parle d’effet hypochrome. → Définition de Tm : C’est la température à laquelle la moitié de l’ADN est sous forme monobrin et l’autre moitié sous forme double brin. Le passage d’une forme à l’autre est brutal du fait du caractère coopératif de la réaction, que ce soit dans un sens ou dans l’autre. Ce passage se visualise très bien si on mesure une DO à 260 nm (UV) car l’ADN simple brin absorbe plus les UV que l’ADN double brin. → Détermination du Tm par le calcul : Si l’ADN est riche en A=T, le Tm est faible. Si l’ADN est riche en G≡C, le Tm est élevé. Pour les oligonucléotides < 18-20 résidus : Tm = 2 x (A+T) + 4 x (G+C) Exemple : 5’ - ATCTGCTACAGTCAGGTTCA - 3’ Tm = 2 x 11 + 4 x 9 = 22+ 36 = 58 °C 2

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b) Spectres d’absorption de l’ADN Le spectrophotomètre permet d’obtenir l’absorbance de la solution, soit la quantité de molécules de la solution. On utilise des longueurs d’ondes que les acides nucléiques peuvent absorbés. Le maximum d’absorbance de molécules d’ADN est de A260nm, et le maximum pour les protéines est de A280nm. → Qualité de l’ADN A260/A280 ≥ 1,8 Entre 1,8 et 2, la solution est dite pure. → Concentration (µg/ml) A260  x facteur de dilution x 50µg/ml A260 = 1 pour [solution ADNdb] à 50 µg/ml A260 = 1 pour [solution ARN] à 40 µg/ml A260 = 1 pour [solution ADNsb] à 33 µg/ml Pour déterminer le Tm, on utilise un spectrophotomètre qui mesure l’absorbance tout en faisant varier la température. Plus la solution est chauffée, plus l’ADN est dénaturé, plus l’absorbance augmente. 2) Hybridation moléculaire : la PCR → L’hybridation moléculaire :

→ Stringence : Les conditions expérimentales de température, pH, et force ionique permettent l’hybridation moléculaire. La stringence est proportionnelle à la température et à l’inverse de la concentration en cations monovalents (Na+ par exemple). Des conditions très stringentes (température élevée, concentrations en Na+ faible) rendent l’hybridation moléculaire plus difficile mais permettent une hybridation spécifique tandis que des conditions peu stringentes (température faible, concentration en Na+ élevée) permettent une hybridation moins spécifique. La PCR permet d’amplifier l’ADN in vitro. A partir d’une molécule, on peut la recopier à l’identique pour 1 cycle de PCR. Le processus se base sur la réplication semi-conservative de l’ADN. On utilise une Taq Polymérase qui est une enzyme ADN polymérase thermostable = thermorésistante avec une demi-vie de 40 min à 95°C.

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Les composants de la réaction de PCR : - Taq Polymérase (enzyme) - un couple d’amorces - dNTP (précurseurs) - ADN génomique matrice Propriétés des ADN polymérases AND dépendante thermostables : Activité polymérase 5’ → 3’ - synthétise de l’ADN du 5’ → 3’ en recopiant une matrice d’ADN orientée 3’ → 5’ (lecture) - pour débuter la synthèse, il lui faut une amorce avec une extrémité 3’-OH libre - pour la synthèse de l’ADN, il lui faut des précurseurs, des dNTP Les deux brins sont copiés en même temps. L’enzyme clive le dNTP entre le phosphate ⍺ et le phosphate ฀, et utilise donc un dNMP qu’elle ajoute à la chaîne avec création d’une liaison phosphodiester et libère un PPi. Les ADN polymérases ne font pas de synthèse de novo. La vitesse de polymérisation de la Taq Polymérase est de ~1000nt/min à 72°C (température optimale), ce qui permet donc de synthétiser de l’ADN à T° > 37°C. La plupart des fragments synthétisés en laboratoire font 200-250 pb. La Taq Polymérase ne fait pas de correction d’erreur sur épreuve “proof reading” (absence d’activité exonucléase 3’ → 5’). Bien dessiner les amorces pour la PCR : - L’amorce du haut correspond à la séquence du brin du bas, et inversement - Les flèches se regardent et sont tournées vers l’intérieur (pas CC----GG sinon formation de boucle) - Le produit PCR a une taille correspondant à la distance entre les amorces, amorces comprises Exemple : amplification 123 à 456 → 457-123 ou 456-122 = 334 pb - Amorces à Tm voisin Les amorces ont toujours une petite taille (~20nt sont suffisants pour avoir une hybridation spécifique), par rapport à la taille du fragment à amplifier. Les amorces doivent comporter au moins 50% de GC de façon à pouvoir s’hybrider sur l’ADN matrice qui, lui, reste dénaturé à la température d’hybridation. → Étapes de la PCR -

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Dénaturation de l’ADN à 95°C (séparation des brins complémentaires) Hybridation des amorces (séquences de nucléotides complémentaires de l’extrémité de la région amplifiée) à une température Thyb = Tmspécifique des amorces - 5°C Elongation (synthèse du brin complémentaire à partir des amorces grâce à l’enzyme ADN polymérase thermostable et aux nucléotides présents dans le milieu réactionnel). Le fonctionnement de l’enzyme est à 72°C.

→ Cycles - Fin du premier cycle de PCR : aucune molécule obtenue ne correspond au produit désiré (passage de 1 molécule à 2 molécules 21 ) - Fin du deuxième cycle de PCR : aucune molécule obtenue ne correspond au produit désiré (passage de 2 molécules à 4 molécules 22)

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Fin du troisième cycle de PCR : Deux produits PCR attendus apparaissent (passage de 4 molécules à 8 molécules 23 dont 2 ont la taille intéressante). Ils vont ensuite se multiplier de façon exponentielle par rapport aux produits non souhaités. Les deux molécules d’intérêt obtenues au troisième cycle donnent chacun deux molécules d’ADN d’intérêt au quatrième cycle.

Augmentation exponentielle des molécules 2n 2n - 2n = nombres de molécules d’intérêt La réaction de PCR est suivie par une purification des molécules sur gel d’électrophorèse. → Purification : Le gel d’agarose est exposé aux UV et le BET colore l’ADN (les molécules) en couleur rouge-orangée. On effectue la PCR grâce à un thermocycler.

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