Protocolo-MTT - Practica para realizar ensayos de viabilidad celular a partir de MTT PDF

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Practica para realizar ensayos de viabilidad celular a partir de MTT...

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Viabilidade celular pela técnica do MTT Protocolo para Células Aderentes 1. Princípio Este

ensaio

baseia-se

na

medida

do

dano

induzido

pelo

composto/extrato em estudo no metabolismo celular de glicídeos usualmente através da avaliação da atividade de desidrogenases mitocondriais. A viabilidade mitocondrial, e conseqüentemente, a viabilidade celular, é quantificada pela redução do MTT (um sal de coloração amarela e solúvel em água) a formazan (sal de coloração arroxeada e insolúvel em água) pela atividade daquelas enzimas. Dessa forma, a redução do MTT a formazan, será diretamente proporcional à atividade mitocondrial e a viabilidade celular.

2. Amostra Células aderentes cuja viabilidade celular deseja-se avaliar após o seu tratamento com o composto/extrato em estudo. 3. Reagentes/soluções/ suspensão celular 3.1. Meio de cultura suplementado com soro fetal bovino (SBF) e solução de antibióticos (penicilina 10.000u/mL e estreptomicina 10.000µg/mL) Normalmente, para células aderentes, é utilizado o meio DMEM simples ou rico em glicose, o qual deve ser suplementado com SFB (10%) e solução de antibióticos (1%). 3.2. Solução de MTT (0,5mg/mL) Para preparar de 10 mL da solução de MTT (0,5mg/mL), proceder da seguinte maneira: 1- Preparo da solução estoque a 5mg/mL: Pesar 5mg de MTT e solubilizar em 1 mL de PBS estéril. 2- Preparo da solução 0,5mg/mL: CV=CV 5mg/mL X V = 0,5mg/mL X 10 mL

V= 1 mL da solução estoque Dessa forma, para preparar 10 mL da solução a 0,5mg/mL deve-se utilizar 1 mL da solução estoque e adicionar 9 mL de meio completo. Observações: Este cálculo mostra as quantidades de solução estoque, PBS estéril e de meio completo necessários para preparar 10 mL da solução de MTT a 0,5mg/mL, que refere-se à quantidade necessária para executar o ensaio em uma placa de 96 poços completa. Se você não for utilizar uma placa inteira, reajustar os cálculos! 3.3. Suspensão celular na concentração de 0,5X10 5 células/mL Para preparar uma suspensão celular (0,5X10 5 células/mL), proceder da seguinte maneira: 1- Determinar o número de células existentes nas garrafas de cultivo celular 2- Uma vez determinado o número de células (onde o resultado será expresso em células/mL), fazer regra de três para determinar a quantidade da suspensão celular (proveniente das células da garrafa), bem como a quantidade de meio completo a ser utilizada. Exemplo: Se você determinou o número de 5 x105 células/mL na contagem deverá fazer a seguinte regra de três: 5 x105 ----- 1000µl 0,5 X105 -----

X

X= 100µl Ou seja, em 100 µl da suspensão celular da garrafa você possui 0,5 X 10 5 célula. Para obter 1 mL de uma suspensão de 0,5X10 5 células/mL, bastaria pegar os 100 µl da suspensão celular da garrafa e adicionar 900 µl de meio completo. Posteriormente, você deve ajustar os cálculos para quantos mL de suspensão celular necessitará para realizar o teste.

4. Procedimento 1- Preparar uma suspensão celular na concentração de 0,5X10 5 células/mL. Levar em consideração o número de poços a serem utilizados e o fato de que em cada poço, devem ser adicionados 200 µl dessa suspensão celular. 2- Adicionar em cada poço, 200 µl da suspensão celular.

3- Incubar a placa na estufa de CO2 pelo período de 24 horas. 4- Retirar o meio de cultura. 5- Tratar as células com 100 µl das respectivas soluções controle e compostos teste nas concentrações desejadas. 6- Incubar a placa na estufa de CO2 pelo período de 24, 48 ou 72 horas. 7- Retirar o meio de cultura. 8- Lavar os poços 2X com 200 µl de PBS estéril a temperatura de 37ºC. 9- Adicionar a todos os poços 100 µl da solução de MTT (0,5mg/mL). 10- Incubar a placa na estufa de CO2 pelo período de 2 horas. 11- Retirar a solução de MTT da placa. 12- Adicionar a todos os poços (INCLUSIVE NO BRANCO) 100µl de DMSO puro. 13- Agitar a placa no agitador de placa pelo período de 5 minutos. 14- retirar a placa do agitador e esperar 5 minutos para estabilização da cor. 15- Fazer a leitura a 540 nM. 5. Cálculos Deve-se calcular a média de absorbância de todos os testes, inclusive do BRANCO e dos CONTROLES. Posteriormente, deve-se subtrair a média da absorbância do BRANCO de todos os testes, inclusive do CONTROLE. O valor obtido pela subtração da média dos controles pela média dos brancos deve ser considerado como 100% de células viáveis. Para os demais testes, deve-se fazer uma regra de três (utilizar o valor obtido pela subtração da média dos testes pela média dos brancos) para obter o percentual de células viáveis....