Saggio MTT - mtt PDF

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Le piastre multiwell da 96 pozzetti nelle 24, 48, 72 e 96 h successive al trattamento sono state bloccate con la soluzione MTT, dalla quale è possibile determinare la proliferazione cellulare e tramite lettura allo spettrofotometro, alla lunghezza d’onda di 570nm, è stato possibile costruire la curva di crescita. Il saggio con MTT è un test colorimetrico quantitativo che permette di testare la proliferazione e la vitalità cellulare. Il saggio si basa sulla capacità degli enzimi succinato deidrogenasi mitocondriali, presenti nelle cellule vitali, di ridurre il sale di tetrazolio MTT (bromuro di 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolio), di color giallo, in cristalli di formazano, mediante rottura dell’anello tetrazolico. I cristalli hanno una colorazione porpora e sono insolubili in soluzioni acquose. La procedura del test di vitalità cellulare prevede che in ogni pozzetto vengano depositati 10 µl di una soluzione di MTT 0.5 mg/ml (1:10 rispetto ad un volume finale di 100 µl) e il tutto venga incubato per 3 ore a 37°C con un’atmosfera di CO2 al 5% e satura di umidità. Finito il tempo di incubazione, ogni pozzetto della piastra multiwell viene lavato dalla soluzione di MTT con PBS 100 µl/pz, eliminato il PBS vengono aggiunti 100 µl/pz di HCl 0.1N in isopropanolo per far sciogliere i cristalli di formazano formatisi in seguito a riduzione dell’MTT. I cristalli ridisciolti in HCl 0.1N in isopropanolo formano una soluzione purpurea misurata spettrofotometricamente a 570 nm. I valori di assorbanza sono proporzionali alla quantità di formazano prodotta e, quindi all’attività metabolica e alla vitalità cellulare. Questo test fornisce un’indicazione relativa della popolazione cellulare vitale e permette di valutare la tossicità di una sostanza, attraverso il confronto tra gli indici di vitalità cellulare ottenuti dalle cellule trattate rispetto ai controlli. I risultati ottenuti dalla curva di crescita mostrano che la proliferazione cellulare HepG2 aumenta alle 72h dal trattamento alle concentrazioni 5ng/ml e 10ng/ml rispetto al controllo e alle concentrazioni 0.05 ng/ml, 0.1 ng/ml, 1 ng/ml....