Protokoll Transformation von E.coli PDF

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Protokoll Transformation von E.coli...

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Einleitung Das Thema dieses Praktikumstags ist die Transformation von E. coli. Transformation ist die Übertragung von Nukleinsäure in kompetente Bakterienzelle. Sie ist die klassische Methode von Gentransfer bei Prokaryoten und ein Teilschritt der Klonierung. Dadurch können DNA-Moleküle in ausreichender Menge vervielfältigt werden. Die Nukleinsäure wurden als ringförmige DNA (Vektor/Plasmid des Typs pBluescript KS) in die Zellen transformiert. Das Plasmid ist eine extrachromosomale ringförmige DNA, das ein Ori (origin of replication) enthält, wobei es sich vervielfältigen kann. Es enthält auch das LacZ-Gen, welches für die Überprüfung zuständig ist, ob in ein Plasmid, das DNA-Stück mit dem gewünschten Gen eingebaut wurde. Dieses Gen, ist das Gen für die β-Galactosidase. Ein Antibiotikaresistenz-Marker (amp R) im Plasmid ist zuständig für die Überprüfung, ob das Plasmid in die kompetente Zellen aufgenommen wurde. Damit die Bakterienzelle mehr kompetent für die Plasmid-Aufnahme sein zu können, wurden sie zuerst vermehrt und in Ca2+-haltigen Medium herangezogen. Diese Kationen sind zur Destabilisierung der Zellwand zuständig. Ein zweiter Schritt für die Erhöhung der Kompetenz ist der Hitzeschock. Er wurde verwendet, um die Fluidität der Membran zu erhöhen und damit das einfacheres DNA- Eindringen zu ermöglichen. Neben der Transformation wurden noch drei Kontrollversuche durchgeführt. Erstes war die Transformationskontrolle, zweites die Vital- und Ampicillinkontrolle und drittes die Weiß-Blau-Selektion. Materialien 300 μl kompetente Bakterienzellen 5 μl DNA (4,3 ng) 2700 μl LB Ampicillin 60 μl IPTG 100 μl X-Gal Methoden Bei der Transformationskontrolle wurden 100 ml kompetente Zellen mit 5 μl ( = 4,3 ng ) DNA gemischt und für 60 min auf Eis. Zunächst wurde das Bakteriengemisch für 90 sec in 42 ° Wasserbad ( Hitzeschock ) gebracht. Das Gemisch wurde dann wieder für 10 min auf Eis. In dieser Zeit erholen sich die Bakterien nach dem HitzeStress. DNA befindet sich schon in den Bakterien. Anschließend wurde 900 μl LB in das Gemisch gegeben und bei 37° geschüttelt. 100 μl wurden auf eine LB-Platte mit Ampicillin aufplattiert. Bei der Vitalkontrolle wurden 100 μl kompetente Zellen ohne DNA-Zugabe für 60 min auf Eis. Zunächst wurde das Bakteriengemisch für 90 sec in 42° Wasserbad ( Hitzeschock ) gebracht. Das Gemisch wurde dann wieder für 10 min auf Eis. Anschließend wurde 900 μl LB in das Gemisch gegeben und bei 37° geschüttelt. 100 μl wurden auf eine LB-Platte ohne Ampicillin aufplattiert. Das gleiche wurde auch für die Ampicillinkontrolle gemacht aber am Ende wurden 100 μl des Gemisches auf eine LB-Platte mit Ampicillin aufplattiert. Bei der letzten Kontrolle wurden 100 ml kompetente Zellen mit 5 μl Ligationsprodukt vorsichtig gemischt und für 60 min auf Eis. Zunächst wurde das Bakteriengemisch für 90 sec in 42 ° Wasserbad ( Hitzeschock ) gebracht und wieder für 10 min auf Eis. Anschließend wurden 900 μl LB in das Gemisch gegeben und bei 37° geschüttelt. Auf eine LB-Platte wurden 100 μl des Gemisches mit Ampicillin, 30 μl IPTG und 50 μl X-Gal aufplattiert. Auf eine zweite LB-Platte wurden 900 μl des Gemisches und für 3 min und 3000 g zentrifugiert. Dabei ist ein Überstand und ein Unterstand entstanden. Das Überstand enthält die Bakterien. 800 μl des Überstandes wurden entfernt. Die restliche 100 μl wurden auf eine LB-Platte mit Ampicillin, 30 μl IPTG und 50 μl X-Gal aufplattiert.

Ergebnisse Mit der Transformationskontrolle wurde gezeigt, wie viele Bakterienzellen das Plasmid aufgenommen haben. Auf der LB-Platte sind die transformierte Zelle als weiße Punkte zu sehen. Diese Punkte wurden gezählt. Durch den Formel der CFU wurden die colony forming units gemessen. 584 cfu / 0,43 = 1,35 * 106 cfu/mg Bei der Vital- und Ampicillinkontrolle wurde keine DNA zugegeben. Bei der Ampicillinkontrolle wurde den Zellen Ampicillin zugegeben. Diese beide Kontrollen zeigen, wie viele Bakterienzelle noch leben. Auf der LBPlatte der Vitalkontrolle wird von einem dichten Bakterienrasen bedeckt. Auf der LB-Platte der Ampicillinkontrolle ist nichts mehr zu sehen, die nicht transformierte Bakterienzellen wachsen nicht. Letzer Kontrollversuch ist die Weiß-Blau-Selektion. Bei dieser Versuch wurden zwei Platte anfertigt. Auf beide Platte sind weiße und blaue Punkte (Bakterien-Kolonien) zu sehen. Die blaue Kolonien sind die Bakterien, die die Plasmide ohne das DNA-Fragment besitzen, also die nicht rekombinante Plasmide. Die weiße Kolonien sind die Bakterien mit den modifizierten Plasmiden. Auf der erste Platte, mit nur 100 μl vom Gemisch sind viel weniger Kolonien, als auf der Platte mit den 900 l, gewachsen. Auf beide Platten sind aber mehr blaue als weiße Kolonien zu sehen. Diskussion In erster Versuch wurde den kompetenten Bakterienzellen 5 l DNA in eine ringförmige Form als Plasmid eingegeben. Da dieses Plasmid aus einer Ligationsreaktion mit einem DNA-Fragment hervorging, enthält nur ein Teil der Plasmide ein Insert in der multiplen Klonierungsstelle. Deshalb wurde eine Antibiotikaresistens zum aussortieren verwendet. Das Plasmid besitzt ein Gen für Ampicillin-resistenz. Normalerweise könnten die Bakterien in einem Medium mit Ampicillin nicht wachsen. Nach der Plasmid-Aufnahme sind sie mit dem darauf vorhandenen Gen resistent undbilden Kolonien. Mit Hilfe der Transformationskontrolle wird untersucht, wie viele Baktierien das Plasmid aufgenommen haben. Diese Bakterien wachsen und erscheinen als weiße Punkte. Mit Hilfe der Vitalkontrolle wurde die Vitalität der Zellen untersucht. Also wie viele Zellen noch leben. Bei der Vitalkontrolle wurde kein DNA und kein Ampicillin den Zellen gegeben. Die Zellen sind also nicht Ampicillin restistenz, aber da es ihnen kein Ampicillin gegeben wurde, leben die Zellen weiter. Auf der Platte ist es ein Bakterienrasen zu sehen Mit Hilfe der Ampicillinkontrolle wurde untersucht, ob die Zellen Ampicillinresistent sind. Den Zellen wurde aber in dieser Versuch kein DNA gegeben, also kein Plasmid mit dem Gen für Ampicillinresistenz. Die Zellen sind damit nicht Ampicillinresistent und können nicht wachsen. Es ist nicht auf der LB-Platte zu sehen. Der letzte Versuch ist die Blau-Weiß-Selektion. Sie dient der Identifikation rekombinanter Bakterien, also der Bakterien, die das Plasmid mit dem gewunschten Gen, enthalten. Hier sind nur die Plasmide geeignet, die das LacZ-Gen, den Gen für eine β-Galaktosidase, besitzen. Bei der rekombinanten Plasmiden, handelt es sich um Plasmide mit einer inaktiven β-Galaktosidase und bei der nicht rekombinanten, handelt es sich um Plasmide mit aktiven β-Galaktosidase. Dieses Enzym spaltet β-Galaktoside in einem blauen Farbstoff ( Indigo) und Galactose. Die blaue Punkte auf der Platte sind die Bakterienkolonien mit den nicht rekombinanten Plasmiden und die weiße Punkte sind die Bakterienkolonien mit den rekombinanten Plasmiden. Literatur Genetik 1 Praktikumsskript zum 1. Praktikum Transformation https://de.wikipedia.org/wiki/Blau-Wei%C3%9F-Selektion von 20.01.2020 http://www.spektrum.de/lexikon/biochemie/vektoren/6547 von 20.01.2020

Universität Leipzig Praktikum Genetik 1 WS 2019/2020

Versuch 1 Transformation von Bakterien

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