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Protokoll zu den Experimenten der ersten Kurswoche...

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Protokoll Woche 1 Klonierung von DNA-Fragmenten in einen Plasmidvektor

2021/22 Betreuerin: Ev

Lena Ana Pra

5545 Kuh msgruppe B

4

Zus In d wurden mehrere Versuche durchgeführt, um die Größe eines unbekannten DNA-Abschnittes aus dem Plastiden-Genom der Modellpflanze Arabidopsis thaliana zu bestimmen. Ein Vektor (hier ein Plasmid) wurde durch Ansatz eines Restriktionsverdaus geöffnet und das zu untersuchende Stück aus dem Plastiden-Genom von A.thaliana wurde anschließend in einem Ligationsansatz in den Vektor inseriert. In einer Transformation wurde der Vektor in kompetente Escherichia coli Bakterienzellen eingebracht. Der Erfolg der Transformation wurde mittels eines Tests auf Antibiotika-Resistenz überprüft, auf die Ligation des Inserts wurde durch Blau-Weiß-Selektion getestet. Anschließend wurde eine Agarose-Gelelektrophorese des Vektors und der Plastiden-DNA jeweils einmal im durch Restriktionsenzyme geschnittenen und ungeschnittenen Zustand durchgeführt, um die Größe der Fragmente zu bestimmen, und zu überprüfen, ob die Restriktionsenzyme, welche die DNA und den Vektor schneiden, aktiv waren. Zudem wurden vier Proben für eine Polymerase Kettenreaktion (PCR) angesetzt, zwei davon mit transformierten Bakterien ohne Inserts und zwei mit transformierten Bakterien mit Inserts. Die Antibiotika-Resistenz-Selektion zeigte, dass die Transformation des Vektors in die Bakterien erfolgreich war. Jedoch beobachteten wir bei der Blau-Weiß-Selektion blaue Kolonien, was auf ein Fehlschlagen der Insertion der Fremd-DNA schließen lässt. Durch die Agarose-Gelelektrophorese konnten die Größen vom durch Restriktionsenzyme geschnittenen und ungeschnittenen Vektor, so wie von der ungeschnittenen und geschnittenen Plastiden-DNA festgestellt werden.

Einleitung Der erste Schritt zur Klonierung eines unbekannten DNA-Fragments in einem Plasmidvektor ist das Ansetzen eines Restriktionsverdaus. In diesem Schritt wird die Plasmid-DNA, in welche im weiteren Verlauf das Gen von A.thaliana inseriert werden soll, mittels Restriktionsenzymen spezifisch geschnitten und dephosphoryliert. Die Spezifität der Schnittstellen der Restriktionsenzyme garantiert, dass die Plastiden-DNA nur an einer festgelegten Stelle in den Plasmid-Vektor inseriert werden kann. Die Dephosphorylierung durch die thermosensitive Alkaline Phosphatase verhindert das Schließen des Vektors, ohne dass das Insert zuvor implementiert wurde. Wenn das Schneiden des Vektors, sowie der Plastiden-DNA korrekt durchgeführt wurde, kann die Plastiden-DNA in einem Ligationsansatz in den Vektor integriert werden, und der rekombinante Plasmid wieder eine Ringstruktur annehmen. Hierfür wird der geschnittene und dephosphorylierte Vektor zusammen mit der geschnittenen Plastiden-DNA, einer Ligase und dem zugehörigen Ligase-Puffer in destilliertes Wasser gegeben und zentrifugiert. Ziel dieser Reaktion ist, die komplementären “sticky ends” des Vektors und der Plastiden-DNA zu überlappen, und somit die Plastiden-DNA in den Vektor zu implementieren. Der rekombinante Vektor kann anschließend in eine Bakterienzelle transformiert werden, damit diese die Plastiden-DNA kloniert. Über zwei Selektionsmechanismen wird sichtbar, ob der Vektor vom Bakterium aufgenommen wurde, und ob dieser die Plastiden-DNA implementiert hat. Da der Vektor ein Antibiotika-Resistenzgen trägt, werden die Bakterien auf ein antibiotikahaltiges Nährmedium gegeben, welches nur Bakterien mit aufgenommenem Vektor eine Kolonisierung ermöglicht.

Des lacZ-Gen, welches für ein Enzym kodiert, dass den farb en Farbstoff umwandeln würde. Die Schnittstelle, an welcher die Plastiden-DNA in den Vektor inseriert werden soll, liegt innerhalb des lacZ-Gens, somit fände eine Inaktivierung des lacZ-Gens bei erfolgreicher Insertion der Plastiden-DNA statt, und die rekombinanten Bakterienkolonien wandeln XGal nicht in einen blauen Farbstoff um, sie erscheinen weiß sofern auf dem Nährmedium XGal aufgetragen wurde. Um die verschiedenen Einflussfaktoren auf diese Reaktion zu kontrollieren, werden außerdem zwei Kontrollen angesetzt. In Kontrolle 1 nutzen wir alle Komponenten des Ligationsansatzes außer der Plastiden-DNA. Der Erwartung nach dürfte in diesem Ansatz keine Bakterienkolonie auf einem antibiotikahaltigen Nährboden entstehen, da das Plasmid, welches das Antibiotika-Resistenzgen enthält, zwar geschnitten, nicht aber ligiert würde. Durch die Dephosphorylierung im Restriktionsansatz verblieben die Vektoren unabhängig vom Vorhandensein der Plastiden-DNA linear, und die Bakterien können keine Antibiotikaresistenz entwickeln, sie können keine Kolonien bilden. In dem zweiten Kontrollansatz sind alle Komponenten des Ligationsansatzes, außer der Plastiden-DNA und der Ligase enthalten. Mittel dieses Ansatzes kann festgestellt werden, ob die Restriktion im ersten Schritt stattgefunden hat. Entstünden in diesem Ansatz Bakterienkolonien, hieße dies, dass bereits das Aufschneiden des Plasmids nicht korrekt ausgeführt wurde, da die Bakterien ausschließlich durch den Vektor eine Antibiotikaresistenz entwickeln können. Das Vorhandensein von Kolonien ist ein Beleg für die Kompetenz der Bakterien und die erfolgreiche Transformation, die weiße Erscheinung der Indikator für rekombinante Klone. Im weiteren Verlauf wurden mittels einer Agarose-Gelelektrophorese der geschnittene und ungeschnittene Vektor, sowie geschnittene und ungeschnittene Plastiden-DNA nach ihrer Größe aufgetrennt. Hierdurch wurde festgestellt, ob die Restriktion im ersten Ansatz erfolgreich war und es lässt sich durch den hinzugefügten DNA-Marker die Größe der DNA-Fragmente bestimmen. Da sich durch das Schneiden die räumliche Konformation der Moleküle ändert, unterscheiden sich auch die Positionen der im Gelbild sichtbaren Banden von geschnittenen und ungeschnittenen DNA-Fragmenten. Während ungeschnittene Plasmide im supercoil-Zustand recht schnell durch die Poren des Agarosegels in Richtung Anode getragen werden können, wandern die geschnittenen und damit linearen Plasmide langsamer durch die Gelmatrix. Da die ungeschnittene Plastiden-DNA ein recht großes Molekül darstellt, ist kaum eine Wanderung durch die kleinen Poren im Gel zu erwarten, während bei der geschnittenen Plastiden-DNA Fragmente in vielen verschiedenen Größen wahrscheinlich sind. In Vorbereitung auf die nächste Praktikumswoche wurden außerdem verschiedene Polymerasekettenreaktion (PCR) -Ansätze hergestellt. Hierfür wurden weiße und blaue Bakterienkolonien resuspendiert und nach Hinzugabe von Primern, Taq-Polymerase, dNTPs und dem PCR-Puffer einer PCR unterzogen. Außerdem wird ein Ansatz mit destilliertem Wasser anstelle der resuspendierten Bakterienkolonien als Blindprobe durchgeführt. Die genutzten Primer binden spezifisch an die Multiple Cloning Site (MCS) des Plasmids, an welcher die Plastiden-DNA inseriert wurde. In der PCR-Reaktion soll die Plastiden-DNA, sofern vorhanden, amplifiziert werden. Mittels einer Gelelektrophorese wird sich anschließend feststellen lassen, ob die Plastiden-DNA in den Ansätzen enthalten war oder nicht.

Des orbereitung für die nächste Woche Über-Nacht-Kulturen von en angesetzt, indem resuspendierte Bakterien in antibiotikahaltiges LB-Medium gegeben wurden. Eine Negativkontrolle mit destilliertem Wasser anstelle von Bakterien wurde von dem Kursleiter angesetzt. Material und Methoden Um eine Bakterien-Transformation mit Plasmid-DNA zu ermöglichen, muss ein Vektor präpariert werden und das Insert vorbereitet werden. Die Plastiden-DNA (pBKS II KS) von A.thaliana wurde durch das Restriktionsenzym TasI, welches eine Erkennungssequenz von vier Basenpaaren hat, in Fragmente verdaut. Die DNA wurde von den Leitenden des Kurses gestellt. Auch der Vektor wurde in einem Restriktionsansatz verdaut, jedoch mit dem Restriktionsenzym EcoRI (siehe Tabelle 1). Dabei wurde EcoRI als letzte Komponente hinzugegeben, und der Ansatz mit einer Pipette mit einem eingestellten Volumen von 10 µl auf- und abpipettiert, um die Komponenten zu mischen. Tabelle 1: Pipettierschema des Ansatzes des Restriktionsverdaus des Vektors mit einem Gesamtvolumen von 40µl

Mengen

Agenzien

10 µl

0,5µg Plasmid-DNA (“Vect”) [50ng/µl)

4µl

10x EcoRI-Puffer (“E Puf”)

26µl

bidest. H2O

0,25µl

5U EcoRI Enzym (“E)

Anschließend wurde der Restriktionsverdau wie im Praktikumsskript auf Seite 8 beschrieben inkubiert. Dem Restriktionsverdau wurde nach ca. 60 Minuten 1µl der thermosensitiven Alkalinen Phosphatase (“AP”) in der Konzentration 1U/µl hinzugefügt, welche die Phosphatreste an den durch EcoRI hervorgerufenen Schnittstellen entfernt und somit einen vorzeitigen Wiederverschluss des Vektors verhindert. Es folgte eine weitere Inkubationszeit. Nach Beendigung der Inkubation wurden das Restriktionsenzym EcoRI und die Alkaline Phosphatase durch Hitze inaktiviert (siehe Skript S. 8). Um das Insert der Plastiden-DNA in den nun linear und dephosphorylierten Vektor einzubringen, wurden Ligationsansätze mit einem Volumen von 20 µl hergestellt . Zusätzlich zu einem Ansatz, der den Vektor, das Insert, die Ligase und den zugehörigen Puffer, sowie Wasser enthielt, wurden zwei Kontrollen angesetzt (siehe Tabelle 2). Kontrolle 1 enthielt alle Komponenten bis auf die Plastiden-DNA. Kontrolle 2 enthielt keine Plastiden-DNA und keine Ligase. Kontrolle 2 wurde nur einmal in der Gruppe angesetzt. Die geschnittene Plastiden-DNA wurde zur Verfügung gestellt. Die Ligase wurde als letzte Komponente hinzugegeben, bevor der Ansatz mit einer Pipette mit einem eingestellten Volumen von 5 µl gemischt wurde. Anschließend erfolgt die Ligationsreaktion (siehe Skript S. 9).

Tabe

tzes und der Kontrollen 1 und 2 mit einem Endvolumen von 20µl

Komponenten

Mengen Ligationsansatz

Mengen Kontrolle 1

Mengen Kontrolle 2

Plasmidvektor [0,25ng/µl]

4,1 µl

4,1 µl

4,1 µl

Plastiden-DNA (Insert) [12,5 ng/µl]

4

ohne

ohne

10x T4-Ligase Puffer

2 µl

2 µl

2 µl

T4 DNA-Ligase [1U/µl]

0,5 µl

0,5 µl

ohne

H2O

9,4 µl

13,4 µl

13,9 µl

Anschließend erfolgte die Transformation des Vektors mit ligierten Insert in kompetente Zellen des E.coli-Stammes DHB10B, welche gestellt wurden. Hier wurde der Anleitung im Skript auf Seite 10 gefolgt. Jedoch wurden die Bakterien nach dem Heat Shock nicht 2 Minuten lang bei 0ºC inkubiert wie angegeben, sondern das LB-Medium wurde direkt hinzugefügt, während das Gefäß auf Eis gelagert war. Das verwendete LB-Medium bestand aus 1% (w/v) Trypton, 0,5% (w/v) Yeast Extract, 0,5% (w/v) NaCl. Das Medium wurde im Voraus mit NaOH auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt und autoklaviert. Anschließend wurden die Bakteriensuspensionen auf LB-Carbenicillin-X-Gal-IPTG Platten ausplattiert und mittels Glasperlen gleichmäßig verteilt. Es folgte eine Inkubation (siehe Skript S. 10). Für die Herstellung der LB-Carbenicillin-X-Gal-IPTG-Platte wurde zum LB-Medium 1,5% (w/v) Agar zugegeben, dies wurde autoklaviert, auf ca. ~50ºC abgekühlt und anschließend mit Carbenicillin (Endkonzentration 100 µg/ml), X-Gal (Endkonzentration 40 µg/ml) und IPTG (Endkonzentration 50µg/ml) gemischt. Durch das Antibiotikum Carbenicillin kann auf das Vorhandensein des Vektors in den transformierten Bakterien getestet werden, denn der Vektor enthält ein Resistenz-Gen gegen dieses Antibiotikum. Das Substrat X-Gal [(5-Brom-4-chlor-3-indolyl)-β-D-galactosid] wurde hinzugegeben, um die Blau-Weiß-Selektion durchzuführen. Wenn das Gen lacZ exprimiert wird, so kann das farblose X-Gal in das blaue Pigment 5-Brom-4-chlor-Indigo umgesetzt werden. Das IPTG, welches der Platte zugesetzt wurde, bindet an den lac-Repressor und ermöglicht so die Transkription und Translation des lacZ-Gens. Um die Größe des Vektors und der Plastiden-DNA festzustellen, wurde eine Gelelektrophorese durchgeführt. Dafür wurden vier Ansätze hergestellt (siehe Tabelle 3). Die DNA-Proben wurden zuvor vom Kursleiter mit 10x DNA-Probenpuffer (2µl für 20 µl Ansatz) versetzt und kurz abzentrifugiert.

Tabe

Ansatz

Komponenten

1: ungeschnittener Vektor

5µl “Vect”, 13µl H2O, 2µl Blaumarker

2: geschnittener Vektor

18µl Restriktionsansatz, 2µl Blaumarker

3: ungeschnittene Plastiden-DNA

18µl “DNA non-dig” Lösung, 2µl Blaumarker

4: geschnittene Plastiden-DNA

8µl “DNA” Lösung, 10µl H2O, 2µl Blaumarker

Die Proben wurden über Nacht gelagert (siehe Skript S. 11), und die Gelelektrophorese dann am nächsten Tag durchgeführt. Die Auftrennung erfolgte in einem Agarosegel mit 1% Agarose, 0,3 µg/ml Ethidiumbromid und 1x TAE, welches aus 40 mM Tris, 20 mM Essigsäure und 1 mM EDTA mit dem pH-Wert 8,0 bestand. (Ethidiumbromid interkaliert zwischen den Basen der DNA, wodurch die DNA-Banden auf einem Transilluminator unter UV-Licht von 300-320 nm Wellenlänge sichtbar werden. Die Probe in Tasche 1 enthielt den ungeschnittenen Vektor und hatte ein Volumen von 18 µl. Auch das Volumen der Probe für die zweite Tasche mit dem Ansatz des Restriktionsverdaus betrug 18 µl. Die Probe für die dritte Tasche mit der zugesetzten ungeschnittenen Plastiden-DNA hatte ein Volumen von 4 µl. In die vierte Tasche wurde eine Probe mit einem Volumen von 18 µl gegeben, welche geschnittene Plastiden-DNA enthielt (siehe Tabelle 4). Die unterschiedlichen Volumen entstanden durch einen Pipettierfehler und können das Ergebnis verfälscht haben. Anschließend liefen die Proben für ca. 60 Minuten bei 60 V Spannung durch das Agarosegel.. Tabelle 4: Auftrageschema von links nach rechts in die Taschen des Agarosegels für die Gelelektrophorese

1

2

3

4

ungeschnittener Vektor

geschnittener Vektor

ungeschnittene Plastiden-DNA

geschnittene Plastiden-DNA

Im letzten Schritt dieser Praktikumswoche wurden die Ansätze für die PolymeraseKettenreaktion (PCR) vorbereitet. Dafür wurden zwei der über Nacht auf der LB-Carbenicillin-X-Gal-IPTG-Platte gewachsenen Blauen Kolonien aufgepickt und jeweils in bidest. H2O resuspensiert und anschließend auf Eis gelagert. Zusätzlich wurden zwei Bakteriensuspensionen mit Bakterien aus weißen Kolonien erstellt, welche gestellt wurden (siehe Skript S. 12). Anschließend wurde der Mastermix für sechs Proben erstellt und in einem Eppi durch aufund abpipettieren gemischt. Neben den vier Ansätzen, die Bakteriensuspensionen enthielten, wurde eine Blindprobe mit 7 µl Wasser erstellt (siehe Tabelle 5). Das Enzym Taq-Polymerase wurde als letztes hinzugefügt und es wurde auf Eis gearbeitet.

Tabe

für die PCR

Mengen

Agenzien

12 µl

10x PCR Puffer

24 µl

dNTP Mix (1 mM, Mix aller 4 dNTPs)

15 µl

T3 Primer (5 pmol/µl)

15 µl

T7 Primer (5 pmol/µl)

12 µl

Taq-Polymerase (0,5 U/µl)

In fünf Eppis wurden je 13 µl des Mastermixes gegeben. Zwei der Eppis wurden 7 µl der blauen Bakterienkolonien-Suspension hinzugefügt, zwei der Eppis wurden mit 7 µl der weißen Bakterienkolonien-Suspension befüllt. Ein Eppi wurde mit 7 µl H2O aufgefüllt. Die Ansätze wurden durch auf- und abpipettieren gemischt. Anschließend wurden die Proben in den Thermocycler gegeben, wo die PCR in 35 Zyklen ablief (siehe Tabelle 6). Vor dem Start der PCR befanden die Ansätze noch etwa eine Stunde ungekühlt in dem Träger, da die Apparatur aus Versehen nicht gestartet wurde. Tabelle 6: Zyklen der PCR im Thermocycler

Zeit

Temperatur

180 sec

bei 95ºC

20 sec

bei 95ºC

20 sec

bei 55ºC

45 sec

bei 72ºC

300 sec

bei 72ºC

Nach Beendigung der 35 Zyklen der PCR wurden die Proben bis zur Entnahme bei 16ºC im Gerät gelagert. Für die nächste Praktikumswoche wurden Über-Nacht-Kulturen von je zwei blauen und zwei weißen Kolonien (gestellt) angesetzt. In je ein Röhrchen wurden 3 ml LB-Medium gefüllt und Bakteriensuspension hinzugefügt. Bei den beiden Über-Nacht-Kulturen mit resuspendierten Bakterien der blauen Kulturen wurden anders als im Skript vorgesehen nur 10µl Bakteriensuspension hinzugefügt, da nicht mehr ausreichend Volumen vorhanden war, von den weißen Kolonien wurden je 20 µl Suspension in das LB-Medium gegeben.

Erg Im e t, ob die Escherichia Coli Zellen kompetent waren, und eine Transformation stattgefunden hat. Dies ergibt sich durch die Antibiotika-Sensitivität des Bakterienstammes, welche eine Koloniebildung bei Anwesenheit von Antibiotika verhindert. Durch die Zugabe von Carbenicillin auf die Agarplatte wurden nicht kompetente Bakterien selektiert. Nur Bakterien, welche das Plasmid, das Träger eines Carbenicillin-Resistenz Gens ist, inseriert haben, können auf dem Nährboden Kolonien bilden. Auf der Agarplatte entstanden zahlreiche Kolonien (siehe Abbildung 1.1), die Transformation war erfolgreich. In der Kontrolle 1 erkennt man das vollständige Fehlen von Kolonien (siehe Abbildung 1.2), hier war keine Plastiden-DNA im Ligationsansatz vorhanden und demnach war kein Ringschluss nach der Restriktion und Dephosphorylierung des Plasmids möglich. Ohne die Transformation sterben die Bakterien auf der Agarplatte ab. In der Kontrolle 2 bildeten sich unerwarteterweise einige Kolonien, auch hier waren also transformierte Bakterien vorhanden.

Abbildung 1.1. Ligationsansatz auf einer LB-Carbenicillin-X-Gal-IPTG-Platte Abbildung 1.2. Ligationsansatz der Kontrolle 1 auf einer LB-Carbenicillin-X-Gal-IPTG-Platte

Mittels der Blau-Weiß-Selektion wurde überprüft, ob die Rekombination des Plasmids erfolgreich war. Im Ligationsansatz sind zahlreiche blaue Kolonien entstanden (siehe Abbildung 1.1.), weiße Kolonien ließen sich nicht erkennen. Die Transformation war also erfolgreich, die Klonierung jedoch nicht. In Kontrolle 1 sind wie zuvor erwähnt weder blaue noch weiße Kolonien entstanden (siehe Abbildung 1.2.). In der Kontrolle 2 waren ebenfalls blaue Kolonien zu erkennen, jedoch nur in geringer Zahl. Die Ergebnisse der Agarose-Gelelektrophorese entsprachen den Erwartungen teilweise (siehe Abbildung 2). Die dem ersten Ansatz zugehörigen Banden, welche der Größenauftrennung des ungeschnittenen Vektors entsprechen, befinden sich aufgrund der supercoil-Konformation größtenteils etwas unter der Position eines 3kb großen Fragmentes. Außerdem sind schwächere Banden höher gelegen zu erkennen. Die Banden des zweiten Ansatzes, also der geschnittenen Vektor-DNA ähneln den Banden des ersten Ansatzes auffallend, sie befinden sich auf gleicher Höhe. Die Bande der ungeschnittenen Plastiden-DNA ist nicht sichtb chnittenen Plastiden-DNA zahlreiche Banden sowie ein weißer Schimmer deutlich erkennbar sind.

Diskussion Im ersten Versuch wurde untersucht, ob die Transformation der Escherichia Coli Zellen funktioniert hat. Das Vorhandensein von Kolonien auf der LB-Platte (siehe Abbildung 1.1.) ist darauf zurückzuführen, dass die normalerweise Antibiotika-sensitiven E.Coli Bakterien durch die Aufnahme eines Plasmids eine Resistenz gegen das Antibiotikum entwickelt haben. Da das Plasmid ein Carbencillinresistenzgen trägt, ist es transformierten Bakterien möglich, Kolonien zu bilden, auch wenn Carbenicillin auf dem Nährmedium enthalten ist. In Kontrolle 1 sind die Erwartungen eingetroffen, ohne die Plastiden-DNA konnten sich keine Kolonien bilden (siehe Abbildung 1.2.). Dies validiert, dass das Schneiden und Dephosphorylieren des Vektors erfolgreich war. Durch die Dephosphorylierung der Plasmiden-DNA kann kein Ringschluss ohne das Insert stattfinden und die Bakterien können keine Antibiotika-Resistenz entwickeln, da der Vektor in der Bakterienzelle nicht ins Genom eingesetzt, sondern degradiert wird. In Kontrolle 2, in...