Gruppenarbeit - Protokoll - DNA Präparation, PCR, Gelelektrophorese PDF

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Protokoll - DNA Präparation, PCR, Gelelektrophorese...

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1 Danny Krüger ( [email protected]) Woche: 16.07-20.07 Gruppe 6

Protokoll Biochemie DNA Präparation/PCR/Gelelektrophorese

Inhalt I. Einleitung II. Methoden a. Ansatz der PCR III. Ergebnisse a. Konzentration und Reinheit der DNA b. Gelelektrophorese IV. Diskussion V. Anhang

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Einleitung Um eine DNA zu Präparieren und die Funktion und Qualität der extrahierten DNA zu überprüfen, wird eine Vielzahl von Schritten unternommen. Bei der Eigentlichen Präparation verwendet man das Prinzip des enzymatischen Aufschlusses. Verschiedene Stoffe, wie SDS, CTAB, oder Proteinase K schließen die Zellen auf. Um die Proteine dann aus unserer Probe( E. coli) zu extrahieren, wird Phenol und Chloroform verwendet, in denen sich die Zellreste auflösen. Um die DNA nicht ebenfalls zu zerstören, muss unbedingt ein pH-Wert von 7,8 eingehalten werden. Um eine sichere Trennung der DNA von anderen Zellbestandteilen zu sichern, wird dieser Schritt wiederholt. Nachdem die Zellreste entfernt wurden, wird die DNA ausgefällt mit Hilfe von Isopropanol. Um die Aktivität der Taq Polymerase und damit, die Aufreinigung zu prüfen, wird nun die extrahierte E.coli DNA aus Versuch 4 mittels PCR vervielfältigt. Bei der PCR, beginnt man als erstes mit der Denaturierung der DNA. Bei 95°C wird die DNA in eintel Stränge aufgetrennt. Dieser Vorgang dauert ca. 1 Minute. Mit Hilfe des Primer, wird die Ausbildung zweier neuer Stränge begonnen, um in der Synthesephase, mit dem Primer als Startpunkt, die Stränge voll zu synthetisieren. Die Wiederholung der PCR ist sehr wichtig, da mit jedem neuen zyklus der PCR, die DNA exponentiell vermehrt wird. Für die Auswertung der Taq Aktivität, hilft uns die Gelelektrophorese. Dabei wird Agarose in einem Puffer aufgekocht und in eine Form gegossen. Je höher die Konzentration der Agarose ist, umso kleiner sind die Poren im Gel. Deswegen ist die Konzentration der zu untersuchenden Medien anzupassen.Den zu untersuchenden Proben wird ein Ladepuffer hinzugefügt,zum einen damit die Probe in der Tasche verbleibt ( auslaufen soll verhindert werden), zum anderen um die laufmittelfront zu makieren . Da die DNA negativ geladen ist, diffundieren die Teilchen zur positiven Anode. Die Poren, haben dabei eine Siebwirkung, was die unterschiedlichen Teilchen der Größe nach trennt. Somit ist die DNA erkennbar und die Aktivität auswertbar.

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Methoden Bei allen drei Versuchen, wurde laut Skript vorgegangen. Veränderung gab es bei Versuch 4: pH-Wert des TE-Puffers 7,8. Des Weiteren wurde die Taq von Gruppe 5 verwendet, da die Taq von Gruppe 6, nicht in optimaler Form vorlag.

Tabelle zum Ansatz der PCR Berechnung (Mastermix) Substanz

1 Probe

20 Proben

Puffer dNTPs (2,5 mM)

3 µl 2 µl

60 µl 40 µl

Primer 616f Primer 1496r

1 µl 1 µl

20 µl 20 µl

A. bidest Magnesiumchlorid

18 µl 3 µl

360 µl 60 µl

Gesamt

28 µl

560 µl

Tab.:1

Zusätzlich wurde zu jeder Probe 1 µl E. coli DNA und 1 µl Taq-Polymerase aus den verschiedenen Reinigungsschritten gegeben. Bei den Elutionsfraktionen haben wir, aufgrund starker Verdünnung der Taq, 3 µl verwendet.

Ergebnisse Konzentration und Reinheit der DNA

Nanodrop Konzentration

415,1ng/µl

260/280

2,39

260/230

2,45

Tab.:2

Um die DNA Extraktion auf ihre Reinheit und Konzentration zu untersuchen, wurde die Absorption bei 230, 260, 280 und 320 nm, mit dem Nanodrop gemessen. Dabei spielen die

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Verhältnisse von 260/280 und 260/230 eine bedeutende Rolle. Das Verhältnis von 260/280 gibt die Konzentration von Kohlenhydraten in unserer Probe an. Der optimale Wert hierfür liegt bei ≥ 2. Anhand der Tabelle 1 sieht man, das unser Wert mit 2,39 im Optimum liegt. Dies bedeutet, dass wenige Kohlenhydrate in unserer extrahierten DNA vorhanden sind. Das Verhältnis von 260/230 gibt die Konzentration von Proteinen in unserer DNA an. Dabei liegt der optimale Wert zwischen 2,0 und 0, 2. Anhand des Wertes aus der Tabelle erkennt man, das unser Wert, mit 2,45, leicht außerhalb des optimalen Bereiches ist. Die Konzentration wird bei 320nm vermessen. Grund dafür ist eine eventuelle Verunreinigung durch Salze. Das Optimum ist bei 400 ng/µl. Unser Wert von 415 ng/µl liegt nah am Optimum.

Gelelektrophorese Anhand der Gelelektrophorese, kann die Taq Aktivität bei bestimmten Reinigungsstufen überprüft werden.

Abb.:1

Abbildung 1 zeigt das Agarosegel der extrahierten DNA. Probe 1 ist ein Marker. Er ist notwendig für den Vergleich der anderen Proben. Die einzelnen Banden ergeben die Basenpaaranzahl. Die unterste Bande, hat die geringste Basenpaaranzahl, der

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Oberste hingegen, die höchste Anzahl. Probe 2-17 zeigt die verschiedenen Reinigungsschritte, die zur Isolierung der Taq, aus E. coli, verwendet wurden. Hierbei sieht man, dass nur bei Probe 14, Banden zu erkennen sind. Bei Probe 18 erkennt man eine dicke Bande. Dies ist unsere Positivkontrolle, wo käuflich erworbene Taq verwendet wurde. Bei Probe 19, welche unsere Negativkontrolle ist, sieht man auch eine schwache Bande. Um eine gute Aktivität zu erkennen, sollte die Bande bei 1,6kp liegen. Die primer binden im Gen der 16s rRNA, die die spezielle Ladung bei 1600bp hat.Dies ist bei Probe 14, 18 und 19 zu erkennen.

Diskussion Um die Reinheit zu überprüfen, wurde unsere Probe bei verschiedenen Wellenlängen mit dem Nanodrop gemessen. Unsere Probe hat 2 unterschiedliche Ergebnisse. Zu einem liegt unser 260/280 Wert bei 2,39. Dieser Wert liegt im Optimum und bedeutet, dass wenige Kohlenhydrate in der DNA vorhanden sind. Andererseits liegt unser 260/230 Wert außerhalb des Optimums, dies bedeutet eine stärkere Verunreinigung unserer DNA mit Proteinen, als erwünscht. Jedoch liegt unsere DNA Konzentration mit 415 ng/µl sehr nahe an den optimalen 400 ng/µl. Dies bedeutet eine sehr gute DNA Extraktion aus unseren E.coli. Letztendlich haben wir eine gute DNA-Probe erhalten, mit einen leicht erhöhten Protein Wert. Bei der DNA Auswertung mit den Agarosegel, erkennt man einen Streifen bei Probe 14 (Anionenaustauscher 5), zwischen 2kb und 1,5kb. Dies zeigt eine Taq- Aktivität. Auch die Positivkontrolle (18) ist positiv und zeigt sich ebenfalls mit einer Bande bei 1,6kb. Diese Kontrolle beweist die Taq Anwesenheit und Aktivität. Jedoch ist auch bei der Negativkontrolle, eine Aktivität zu erkennen, die nicht erwünscht ist. Dies könnte durch Verunreinigungen entstanden sein. Die restlichen Proben zeigen keine TaqAktivität. Somit erkennt man, dass keine Taq vorhanden ist und die Reinigungsstrategien gewirkt haben.

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Abb.: 2

Das Agarosegel von Gruppe 5 zeigt Ähnlichkeiten. Jedoch sind da schon TaqAktivitäten bei der Hitzefällung vom Pellet (3), der Gelfiltration (7-9) und Anionenaustauscher (13,14) zu erkennen. Die Taq- Aktivität bei Probe 13 und 14 deckt sich mit dem Ergebnis von Gruppe 6. Jedoch zeigen die anderen Ergebnisse, eine frühzeitige Aktivität und somit eine nicht gelungene Reinigung der DNA. Bei der Negativkontrolle, ist auch bei Gruppe 5 eine Aktivität zu erkennen, die nicht erwünscht ist. Dies kann ebenfalls auf Verunreinigung der Probe rückzuführen sein. Zum Abschluss kann man sagen, dass bis auf ein paar kleinen Abweichungen, das Ergebnis zufrieden stellend ist und die DNA erfolgreich extrahiert wurde.

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Anhang I. Tab.: 1

Ansatz der PCR Berechnung

II. Tab.: 2

Konzentration und Reinheit der DNA 3

III. Abb.: 1

DNA Gelelektrophorese Gr. 6

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IV. Abb.: 2

DNA Gelelektrophorese Gr. 5

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Legende Abb.: 1, 2 1. Marker 2. Rohextrakt 3. Hitzefällung Pellet 4. Hitzefällung Überstand 5. As Pellet 6. As Überstand 7. Gf: 2 8. Gf: 3 9. Gf: 4 10. Gf: 5 11. At: 2 12. At: 3 13. At: 4 14. At: 5 15. At: 6 16. At: 7 17. At: 8 18. Positivkontrolle 19. Negativkontrolle

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