Regolazione genica eucarioti PDF

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Appunti sulla regolazione genica degli eucarioti...

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REGOLAZIONE DELL’ESPRESSIONE GENICA NEGLI EUCARIOTI. • regolazione breve termine. I geni vengono rapidamente attivato e repressi in risposta a cambiamenti nelle condizioni ambientali o fisiologiche della cellula o dell’organismo." • regolazione a lungo termine :Coinvolge tutti una serie Geni implicati dello sviluppo e nella differenziazione di un organismo in modo che solo una parte del genoma sia espresso, questo meccanismo di silenziamento genomico si trasmetta alle cellula figlia, una cellula che e in grado di esprimente solo un pacchetto di geni (ciò non accade nei procarioti, anche se ci sta un modello simile che potremmo paragonare nei procarioti, ovvero la trasformazione )" (la cellula eucariote differisce essenzialmente dalla procuriate perche ha tutto quello che gli serve per compiere i propri cilci senza dover agganciarsi ad altri organismi. )" Differenziazione cellulare: le cellule eucariote hanno tutte lo stesso corredo genetico ma possono differenziarsi ovvero avere strutture e comportamenti molto diversi." Vogliamo capire quali sono i meccanismi di regolazione che portano a questo, e lo possiamo dimostrare semplicemente con il primo esperimento di clonaggio (quello della pecora Dolly in cui hanno preso una cellula uovo a cui e stato esportato il fuso meiotico, ed e stato preso il fuso di una cellula epiteliale, e comunque si e sviluppato un clone.)"

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cosa differenzia un organismo eucariote da uno procuriate?! non e solo la membrana nucleare, ma anche quella che e l’organizzazione genica." Organizzazione procarioti : Policistronica (C’e corrispondenza diretta tra gene e prodotto polipeptidico, per quei geni che codificano per prodotti polipetidici)" Organizzazione eucarioti : Monocistronica. (non ci sta la corrispondenza diretta sopra citata) " esempio un gene con 3000 coppie di basi, codifica per un polipeptide da 1000 amminoacidi, significa che ci sta linearità, questa cosa in eucarioti un gene di 3000 basi, potrà esprimere prodotti di anche 300 aa." Andando piu nel dettaglio. ci dobbiamo ricordare i segnali che governano l’inizio della trascrizione ( poi vedremo anche i segnali che governano l’inizio della traduzione ecc.) " In procarioti e lieviti (eucarioti semplici ) i segnali di inizio sono tutti a monte del promotore." in Eucarioti, invece i segali possono essere anche a valle del promotore. I segnali molecolari che sono responsabili dell’inizio della trascrizione possono avere pozioni vicine o lontano il sito di inizio della trascrizione, posso stare a monte o valle e funzionare in entrambe le orientazioni." questa e una rappresentazione schematica dell’ organizzazione dei promotori di procarioti e due tipi di eucarioti, sono messi in evidenza gli elementi che governando la trascrizione."

la condizione essenziale che differenzia poi procarioti da eucarioti: IL DNA DEVE ESSERE DISPONIBILE. in procarioti e tutto trascrizionalmente attivo, sta giusto un po aggrovigliato su proteine nel nucleosoma;" in eucarioti no , e sempre associato proteine ed ha livelli di organizzazione piu complessi." la strutturazione del DNA e un meccanismo fondamentale della regolazione dell’espressione genica. Eucromatina : meno condensata e trascrivibile" Eterocromatina: poi condensata e non trascrivibile." quali sono le modifiche post trascrizione che portano il pre-mRNA a mRNA?" •CUPPING 5’. Comincia a essere sintetizzato il trascritto e questo in 5’ ha 3 fosfati , nessun DNA avrà mai un trifosfato, quindi e una segnale molecolare ben preciso; ci sarà un enzima che addiziona una guanosina fosfato; viene catalizzata l’adesione all’estremita 5’ trifosfato dell’RNA appena sintetizzato da un enzima che fa un legame 5’-5’ fosfoanidrinico, che un legame inusuale, ( questo e anche uno dei segali piu importanti per l’inizio della traduzione). La formazione del cappuccio avviene quando si incontrano le estremità 5’ e 3’quindi e cotrascrizionale." " •ESCISSIONE DEGLI INTONI DELLE SEQUENZE NON CODIFICANTI. le Small Ribo Nucleic Particols sono fatte di RNA e proteine ( come le telomerasi, e i ribosomi ). Si uniscono le proteine si ha lo splicing, vedremo che anche questo puo essere un momento di regolazione." •FORMAZIONE DELLA CODA DI POLIADENILAZIONE. " che e una modifica post-trascrizionale. E un altro momento di regolazione, solo dopo che e maturato ,il trascritto puo uscire fuori." per far incominciare a traduzione c’e bisogno della stabilita del trascritto, e a giocare un ruolo fondamentale sono il camping e la coda di Poli A, che fa circolarizzare il trascritto fisicamente, non chimicamente, questo facilita il processo di inizio e sintesi proteica, quindi e importante che sia integro. " Nella traduzione viene sintetizza una catena proteica, che deve essere “strutturata” (dire così all’esame) che comporta anche modifiche post traduzionali tipo formazione di ponti disolfurici (la cisteina ha il gruppo tiolico), glicosilazione ecc. " La proteina deve funzionare nel giusto comparto, non puo funzionare fuori, perche altrimenti non espleta la funzione per cui e stata sintetizzata ma fa un altra funzione." Processo di degradazione: le cellule consumano ATP per degradare, quindi e importante regolarlo. Vediamo come i momenti di controllo sono molteplici. A tutti questi livelli e possibile che avvengono regolazioni che modificano il livello di espressione." (qui a fianco schema di tutti i possibili controlli)"

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Dobbiamo ricordarci questa slide, perché ci sottolinea che e la formazione del complesso di inizio della trascrizione e un poco piu complessa negli eucarioti che nei procarioti." Ci sono fattori a monte o valle (poco importa ) che devono essere riconosciuti dalle proteine, e che chiameremo “fattori di trascrizione” che sono in grado poi di formare un complesso che regola l’RNA polimerasi, e avremo anche fattori di trascrizione basali." Negli eucarioti ci sono 3 diverse RNApol che catalizzano la trascrizione di 3 diverse classi di RNA , e i geni di queste tre classi, differiscono per la struttura del promotore." Qui stiamo parlano dei geni di classe 2 che codificano per proteine.. (questa e la struttura di un protone per gene di classe 2)" ci sono fattori di trascrizione prossimali e distali (possiamo chiamarli enhancer o silencer ) che funzionano attraverso l’integrazione di piu proteine fra di loro ." Possiamo classificare i geni in qualche modo, tipo i geni housechiping ( geni che devono essere espressi in tutti i tipi cellulari sempre allo stesso livello, noi li chiameremo costitutivi.)" (durante lo sviluppo di un uomo cambia il tipo di geni che vengono espressi e la composizione in subunità dell’emoglobina, perche quando l’organismo in sviluppo, prende l’ossigeno dal sangue della madre , tramite

uno scambio, per poterlo prendere, il sangue del feto deve avere un affienita maggiore, e se fosse l’emoglobina di un adulto, non avrebbe questa affinità che gli serve)" Questo e l’inquadramento del sistema di regolazione genica degli eucarioti. AMPLIFICAZIONE GENICA. L’evoluzione ha selezionato un processo di amplificazione genica in particolari momenti della vita di una cellula, ad esempio usa questo meccanismo quando c’e bisogno di un grande quantità delle funzioni codificate da quel gene, fenomeno che avviene spesso nell’ oogenesi delle rane." Per duplicare il DNA ci servono molte proteine, e questa amplificazione genica avviene proprio quando si devono produrre tutti questi ribosomi." L'amplificazione selettiva di specifiche regioni del genoma, principalmente nelle cellule eucariotiche, si verifica nei normali processi di sviluppo e come conseguenza di particolari situazioni di stress metabolico. Durante l'oogenesi in alcuni anfibi i geni che codificano per l'RNA ribosomale aumentano di circa 2000 volte il numero di copie, in preparazione alla grande quantità di sintesi proteica che deve verificarsi nello sviluppo iniziale. Il DNA amplificato è sotto forma di cerchi extracromosomici, ognuno dei quali contiene diverse copie della ripetizione del DNA ribosomiale e un'origine di replicazione. Una situazione simile è stata analizzata in Drosophila, in cui i geni che codificano le proteine dell'uovo sono amplificati in una particolare fase di sviluppo." Apparentemente, entrambi i tipi di meccanismi si verificano durante lo sviluppo di alcune linee cellulari di mammifero resistenti ai farmaci in coltura." L’ Amplificazione dei geni in condizioni selettive è stata ampiamente osservata, ad esempio nello sviluppo di forme di insetti resistenti ai pesticidi. Tali strutture amplificate potrebbero sorgere sia attraverso la ricombinazione con scambio di cromatidi fratelli non uguali, sia con un processo di trasposizione conservativo. Successivamente, la ricombinazione omologa all'interno di una regione amplificata può portare all'asportazione di sequenze contenenti una o più sequenze amplificate. Per replicare autonomamente, queste sequenze escisse devono avere un centromero. Tali elementi rappresentano probabilmente i cromosomi a doppio minuto." La pressione selettiva, come la presenza continua di metotrexato, promuove in modo specifico la sopravvivenza delle cellule che possono rispondere a tale pressione (cioè, producendo una sovrapproduzione di DHFR). Una volta che due o più copie del gene sono presenti su un cromosoma, ulteriori copie possono essere generate da ulteriori eventi ricombinativi o da anormalità della replicazione. La resistenza è quindi sviluppata in modo graduale e si verifica per molte generazioni di crescita."

Regolazione espressione genica negli eucarioti (prima parte) " Il sistema è un po più complesso rispetto a quello procariotico, ma possiamo ragionare in due grossi blocchi A BREVE TERMINE. I geni vengono attivati o repressi, rapidamente, in tempi brevi, in risposta a cambiamento delle condizioni ambientali o fisiologiche della cellula (o dell'organismo) È quello che fondamentalmente funziona per i procarioti. Qui incontriamo la prima complicazione perché, a differenza di quanto avviene nei procarioti, la maggior parte degli eucarioti sono organismi multicellulari, non unicellulari, in cui molte cellule vivono in condizioni controllate: ad esempio, tutte le cellule del sangue vivono in condizioni di pH, temperatura, forza ionica, pressoché costanti. Casi come l'influenza possono variare la temperatura aumentandola di un paio di gradi. " A LUNGO TERMINE. Geni implicati nello sviluppo e nella differenziazione di un organismo." C'è un meccanismo simile per i procarioti? Ni. I procarioti possono sporulare, ma la sporulazione è un cambiamento completo del metabolismo, non un differenziamento cellulare vero e proprio (anche se simile). Da una stessa informazione genetica si posso ottenere cellule che sono in diversi tessuti, di dimensioni e forme e funzionalità diverse. Sicuramente una cellula del fegato e diversa da una del muscolo cardiaco: esprimono pacchetti di informazione completamente diversi. " Però noi vorremmo cercare di capire quali sono i meccanismi molecolari che governano questo." dimostrato che da un'unica cellula, l'uovo fecondato, si originano tutte le cellule per duplicazione, e che posseggono tutte lo stesso genoma tranne le cellule sessuali." Esistono cellule in cui c'è un riarrangiamento genico? (immunochimica e immunologia) " I linfociti! Hanno una parte di DNA ricombinato di cui hanno perso pezzi perché, lo sapete cos'è un anticorpo? Una proteina che è capace di legare, in maniera differente e specifica, una particolare struttura tridimensionale in genere ignota alle mie cellule altrimenti avrei problemi di autoimmunità." Nella vita ci confrontiamo con centinaia di migliaia di determinanti molecolari diversi. Nel genoma ho un patrimonio di centinaia di migliaia di geni che codificano per centinaia di migliaia di anticorpi diversi? Poi dovremmo capire come si sono formati tutti questi geni diversi. Gli anticorpi sono fatti da due catene

proteiche, una pesante ed una leggera, e ciascuna catena ha una parte variabile ed una costante. " Il meccanismo, infatti, di immunizzazione (vaccinazione), qual è? Le cellule si formano continuamente essendo capaci di produrre anticorpi diversi; quando incontrano l'antigene allora il loro ciclo vitale finisce. " Se incontra l'antigene che succede? Si stabilizzano in modo tale che quelle cellule che sono nel mio organismo e si duplicheranno. Infatti, la vaccinazione consiste nel metterti a confronto con un determinante molecolare simile a quello che causa la patologia, ma che non la causi: può essere un virus ucciso o una proteina virale che non dà conseguenze dell'anticorpo. " le esigenze degli eucarioti sono quelle di: •specializzarsi. (perche utilizzano parti diverse del proprio patrimonio genetico per effettuare una determinata funzione ma tutte hanno lo stesso patrimonio genetico e devono differenziarsi e specializzarsi in un certo settore." •convivere con gli altri / comunicare. "

LIVELLI DI CONTROLLO DELL’ESPRESSIONE GENICA. il controllo trascrizionale si puo avere a due livelli ( 3 tecnicamente) :" •controllo trascrizionale: struttura della cromatina, inizio della trascrizione." •controllo post trascrizionale: maturazione, trasporto, traduzione e stabilità dell’mRNA" •controllo post trascrizionale: attivazione, compartimentalizzazione e stabilità delle proteine"

" CONTROLLO TRASCRIZIONALE. ci interessa sapere, cosa a livello molecolare interessa la Struttura della cromatina:" -modifica delgi istoni." -Metilazione del DNA." E importante quindi ricordare i livelli di compattazione della cromatica, e un complesso importante degli eucarioti, mentre nei procarioti e meno importante, infatti al massimo troviamo delle anse." La regolazione dei geni eucariotici, specialmente negli organismi multicellulari, è complicata dal processo di sviluppo specifico degli organismi multicellulari. Ogni organismo multicellulare inizia come uno zigote monocellulare che si divide per mitosi. Le cellule si differenziano in tipi funzionali usando alcuni geni ma ignorando gli altri. I geni Homeobox stabiliscono il piano corporeo e la posizione degli organi in risposta ai gradienti delle molecole regolatrici. La tempistica di alcune espressioni genetiche sembra seguire una sequenza, come la produzione di diversi tipi di emoglobine fetali da parte dei globuli rossi dei mammiferi, che passano all'emoglobina adulta qualche volta dopo la nascita. Chiaramente l'inattivazione di alcuni geni avviene in ogni cellula adulta; qui sta la cura per il cancro, la vecchiaia, ecc." L'eterocromatina colora più fortemente ed è una cromatina più condensata. L'eucromatina si colora debolmente ed è più aperta (meno condensata). L'eucromatina rimane dispersa (non condensata) durante l'interfase, quando si verifica la trascrizione dell'RNA. Alcune regioni dell'eterocromatina sembrano essere strutturali (come nell'eterocromatina vicino alla regione del centromero). I corpi di Barr, i cromosomi X inattivati irreversibilmente, sono anche eterocromatina condensata. Altre regioni di eterocromatina variano da una cellula all'altra. Quando la cellula si differenzia, la proporzione di eterocromatina aumenta con l'eucromatina, riflettendo una maggiore specializzazione della cellula mentre matura. I loop (o sbuffi) nei cromosomi degli insetti sono aree di sintesi attiva dell'RNA, suggerendo nuovamente che i geni funzionali si trovano in aree aperte della cromatina (o, l'eucromatina). Gli eucarioti hanno anche proteine leganti specifiche che funzionano in modo simile ai meccanismi procariotici, tuttavia gli eucarioti, come ci si aspetterebbe, hanno un processo molto più complicato."

La cromatina puo essere anche chimicamente modificata, (metilata) in modo tale da poter distinguere un filamento di nuova sintesi da uno di vecchia sintesi che e metilato." un DNA ipometilato nella zona del promotore e un DNA che puo essere iper espresso. inoltre possono essere modificati chimicamente anche gli istoni (es: acetilazione, ma non e la sola) . quindi nella cromatina attiva, gli istoni saranno acetilati, in quella inattiva saranno deacetilati." Perche l’estone acetilato tende a destrutturare la cromatina, perche l’acetilazione avviene sui gruppi epsilon amminici della lisine e quindi diminuisce l’interazione con lo scheletro della struttura del DNA che e carico negativamente e quindi tende un po piu ad allargarsi. " L’interazione tra DNA e nucleosoma e sito aspecifica. " Queste caratteristiche della cromatina sono quelle che tengono conto della regolazione."

La trascrizione, visto la tipologia di processo che deve avvenire per rendere un tratto di DNA trascrivibile, deve essere necessariamente accompagnata da un rimodellamento della cromatina, ma in generale prevale la regolazione positiva (la regolazione negativa e sostituita dall’inaccessibilità della cromatina); ovviamente ogni gene richieda la sua specifica regolazione. I geni accessibili sono regolati solo positivamente." Per aumentare la specificità, più attivatori proteici interagiscono tra loro diminuendo cosi la probabilità di attivazioni casuale. - i contatti proteina-proteina tra attivatori lontani spesso avvengono grazie alla formazione di anse di DNA. ( abbiamo citato un esempio nei procarioti che operone dell’arabinosio che e un esempio di regolazione per banding di DNA) " Ci si puo domandare perche e cosi complicato il complesso di inizio degli eucarioti: - essendoci molti fattori che devono interagire tra di loro, diminuisce la probabilità di interazione casuale." -il secondo motivo e perche l’organizzazione genica e monocistronica, ovvero ogni gene e regolato indipendentemente."

In cosa consistono, a livello molecolare le modificazioni dello stato di condensazione della cromatina associata alla attivazione trascrizionale? " Risposta: sulla catena veloce rimangono gli istoni parentali, quindi non si dissociano completamente e dopo la trascrizione si riappaia con l’altro istone." Quindi gli istori si decomprimono e rendono accessibile il DNA. "

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ORGANIZZAZIONE DEI NUCLEOSOMI. otto molecole istoniche formano un tetrametro." -2 molecole di H2A" -2 molecole di H2B" -2 molecole di H3" -2 molecole di H4" 146 coppie di basi arrotolate intorno all’ ottametro." l’estone H1 lega il DNA tra gli ottameri."

la cosa importante e che le code degli istoni sporgono dal nucleo ottamerico e gli istoni sono proteine basiche, perche la percentuale di lisina e argini presente negli istoni e piu elevata di un distribuzione statistica, e riescono legarsi al DNA carico negativamente.

L’ istone acetilasi e deacetilasi consentirà l’apertura del DNA e quindi di far legare alcuni fattori di trascrizione, ovviamente le modifiche istoniche sono diverse, fosforilazione, metilazione e ubiquitinazione."

- ACETILAZIONE: implicata nella regolazione dell’espressione genica. Interessa le Lisine (K)" - Metilazione : associata a differenti funzione cromatiniche e alla regione della trascrizione. Interessa le arginine e le lisine (R e K)"

- Fosforilazione: coinvolte nella regolazione della trascrizione, nei processi di riparo del DNA e nella condensazione cromosomica durante la mitosi. Interessa le Serine (S)."

- Ubiquitinazione: critica per i processi di mitosi e di meiosi. Interessa le Lisine (K)." - poli(ADP)Ribosilazione: associata a varie funzioni cromatiniche (condensazione e decondensazione), principalmente rilevamento di danni al DNA, ma anche ad altre funzioni genomiche. Interessa le Glutamine (G)" LA METILAZIONE DEL DNA. in genere il DNA metilato e associato con la cromatina inattiva, mentre il DNA ipometilato e associato ad un gene attivo. La metilazione del DNA è fondamentale per il controllo epigenetico della regolazione genica e si verifica nelle citosine in regioni ricche di ripetizioni CG che possono essere presenti sia nell'eucromatina (isole CG) che nell'eterocromatina (ripetizioni satellitari)." DNA metilato tipicamente associato a cromatina / geni inattivi. Questo si pensa che si verifichi attraverso l'inibizione del legame dei fattori di trascrizione e dei coattivatori poiché la metilazione C5 si verifica nel solco maggiore del DNA." DNA non metilato associato a DNA / geni trascritti La metilazione del DNA può giocare un ruolo come meccanismo di difesa contro gli elementi trasponibili, ma certamente svolge un ruolo regolatore nella regolazione genica" Alcuni...