TRASCRIZIONE NEGLI EUCARIOTI PDF

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SPIEGAZIONE DELLA TRASCRIZIONE NEGLI EUCARIOTI...

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TRASCRIZIONE NEGLI EUCARIOTI Si articola in 3 fasi:  INIZIO  ALLUNGAMENTO  TERMINAZIONE Le RNA Polimerasi non legano i promotori in modo diretto, necessità di FATTORI ADDIZIONALI (TF = fattori di trascrizione della trascrizione), chiamati anche FATTORI GENERALI DELLA TRASCRIZIONE. Ci sono 3 diverse RNA polimerasi con funzioni diverse 1. 2.

3.

RNA POLIMERASI I  TRASCRIVE I GENI PER GLI RNA RIBOSOMIALI 28 S, 5,8 S e 18 S NEL NUCLEOLO. RNA POLIMERASI II  TRASCRIVE I GENI CODIFICANTI PER LE PROTEINE (RNA MESSAGGERI) E LA MAGGIOR PARTE DEI GENI PER I PICCOLI RNA NUCLEARI (snRNA) NEL NUCLEOPLASMA E IN PIU’ TRASCRIVE ANCHE I PICCOLI RNA E ANCHE IL NO CODING-RNA. Gli studi attuali hanno dimostrato che la maggior parte degli RNA, quelli regolatori come: microRNA, no codingRNA, piccoli RNA sono trascritti dalla RNA POL II. RNA POLIMERASI III  TRASCRIVE NEL NUCLEOPLASMA I GENI PER GLI RNA TRANSFER, RNA RIBOSOMIALI 5 S, U6 -snRNA, PICCOLI RNA NUCLEOLARI E CITOPLASMATICI quindi piccoli RNA regolatori.

Per cui vediamo che ciascuna di queste è coinvolta nella trascrizione di specifici RNA.

Se vediamo i colori, riconosciamo delle componenti che si trovano anche negli eucarioti, questo a testimonianza del fatto che quello che noi abbiamo descritto nei procarioti è ritrovabile negli eucarioti.

RNA Polimerasi II -

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Catalizza la trascrizione di tutti i geni codificanti proteine (mRNAs), 4 snRNAs che partecipano allo splicing, piccoli RNA non codificanti. L’RNA polimerasi II è un mega complesso di proteine formata da 2 subunità grandi (Large) L (128-150 kDa) e L’ (160- 220 kDa), e da 12-15 subunità piu’ piccole, alcune specifiche ed altre in comune con l’RNA Pol I e/o III L’estremità carbossi-terminale della subunità più grande, L’, contiene una sequenza di 7 aa (il dominio carbossiterminale o CTD) che e’ ripetuto molte volte (26 volte in lievito, 52 volte in mammiferi). Queste ripetizioni hanno un ruolo strutturale e funzionale molto importante per l’attività biologica di questo enzima. Il CTD (Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser) è essenziale per la vitalità della cellula Il CTD viene fosforilato durante la trascrizione. Lo schema dell’unità di trascrizione trattato per i procarioti vale anche per gli eucarioti. E’ identico come schema non come specificità di organizzazione, nel senso che il promotore degli eucarioti è diverso da quello dei procarioti, nella sua organizzazione di base, però anche negli eucarioti avremo sempre: -

PROMOTORE a monte REGIONE CODIFICANTE REGIONI DI TERMINAZIONE

Il PROMOTORE della RNA POL II è diverso dal PROMOTORE della RNA POL I e III, noi abbiamo 3 tipologie di promotori. L’attività del promotore inizia nel momento in cui il promotore si lega a delle proteine che nel termine generale si chiamano FATTORI DI TRASCRIZIONE. I FATTORI DI TRASCRIZIONE svolgono funzioni differenti, funzioni differenti nel senso che la funzione biologica finale dei TF è una funzione che può essere o di regolazione dell’attività della trascrizione o direttamente necessaria alla RNA POL per funzionare, siccome tutte queste proteine sono capaci di legare direttamente il DNA, quindi sono proteine che hanno nella loro struttura un sito di legame che è specifico per sequenze presenti nel PROMOTORE, tutti i fattori di trascrizioni hanno queste caratteristiche. Inoltre, oltre ad avere questo sito di legame avrebbero un altro sito attivo che gli consente di legare un’altra molecola (proteina, ligando ecc); i legami della proteina con un'altra proteina sono importanti perché regolano l’attività della proteina con il DNA. Quindi i fattori di trascrizione si chiamano così perché da un punto di vista strutturale si somigliano però da un punto di vista funzionale svolgono funzioni differenti, quindi noi li possiamo classificare o da un punto di vista strutturale o da un punto di vista funzionale e NON VANNO CONFUSI. Dunque, a livello del promotore ci sono delle sequenze che sono riconosciute da queste proteine FATTORE DI TRASCRIZIONE, la presenza di questi è essenziale per consentire alla RNA POL di poter procedere nell’attività biologica, senza questi la trascrizione non avviene. PROMOTORE DELLA RNA POL I Vediamo il PUNTO DI INIZO, siamo a livello della REGIONE TRASCRIVIBILE tanto è vero che a conferma di ciò i numeri sono positivi. A monte del PUNTO DI INIZIO troviamo numeri negativi, vediamo una zona molto ampia, i promotori possono essere molto grandi fino a 500-1000 paia basi. Quando vengono presentati i promotori vengono zummate le regioni funzionali. TUTTI i PROMOTORI hanno: -

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una REGIONE CORE a cui si lega la RNA POLIMERASI questa regione core che vicina al sito di inizio della trascrizione, è dove vanno a localizzarsi delle sequenze specifiche che sono riconosciute da proteine, fattori di trascrizione che consentono poi alla RNA POL di potersi legare e trascrivere. una REGIONE PROSSIMALE/DISTALE che contiene le SEQUENZE REGOLATRICI a cui si vanno a legare proteine fattori di trascrizione che regolano l’affinità della RNA POLIMERASI, quindi accelerano, amplificano o silenziano, inibiscono, l’attività della RNA POL e quindi il meccanismo della trascrizione. I due meccanismi sono entrambi importanti. Si possono legare quindi sia attivatori che repressori, comunque la funzione è una funzione di regolazione.

Mentre la trascrizione si deve verificare sempre, ad ogni ciclo cellulare, perché altrimenti si produrrebbero cellule figlie che mancano di materiale genetico, quindi questo è un evento necessario. Mentre l’RNA deve essere prodotto se serve, sennò diventa un problema se viene prodotto se non serve, quindi la sua attivazione o repressione sono degli eventi finemente regolati.

Noi nell’immagine vediamo pressoché la REGIONE DEL CORE in sono presenti gli elementi che aiutano la RNA POL che si deve posizionare e quello che noi vediamo è che ci sono proteine come: SL1, UBF1 le quali la UBF1 è necessaria a creare queste strutture un po' ad ansa del promotore che poi facilita la posizione delle proteine SL1 che consentono il posizionamento della proteina TBP: TATA BINDING PROTEIN. Questa TBP è l’unica proteina comune alle POLIMERASI, la ritroviamo in tutti i promotori, ed è un po' il fattore sigma delle polimerasi degli eucarioti, cioè la polimerasi di fatto non si aggancia direttamente al DNA ma alla proteina TBP. Quindi in questo caso, rispetto al punto di inizio, noi abbiamo delle regioni ricche di A,T,C,G che si trovano fino a circa 40 paia di basi a monte del promotore, dopodiché tutta l’altra regione è la REGIONE CORE perché è il sito di legame della proteine UBF, che si lega e crea una distorsione del DNA, gli fa fare una specie di avvolgimento. Le conformazioni, lo abbiamo sempre detto, sono utili perché formano delle strutture che aiutano i vari complessi a svolgere delle attività, delle funzioni. Questo della RNA POL III è un po' una situazione al limite. Qui abbiamo 2 TIPI DI PROMOTORE: -

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PROMOTORE INTERNI si chiamano così perché alcuni elementi che sono propri della funzione del promotore si trovano all’interno della regione di trascrizione. Per cui l’RNA che viene trascritto conterrà anche delle regioni che appartenevano al promotore. PROMOTORE A MONTE

PROMOTORI INTERNI È sempre vera la regola che tutti i promotori sono sempre a monte dei geni, della regione che viene non lo abbiamo mai a valle, ma semplicemente il promotore interno sconfina un po' nella regione di trascrizione. Non abbiamo prima il gene e poi il promotore, perché altrimenti la polimerasi non potrebbe funzionare. Questi elementi funzionali sono indicati con la sigla boxA e boxC o boxA e boxC, hanno delle posizioni fisse rispetto al punto di inizio della trascrizione e servono a consentire il legame di queste proteine, che sono FATTORI DI TRASCRIZIONE, molto grandi e complesse che possono legarsi o al boxA e boxC o boxA e boxC e a seconda di come si legano replicano in modo diverso.

Cambiano i fattori di trascrizione che si legano alle sequenze specifiche, ma comunque creano il sito di accomodamento per la proteina TBP (la proteina TBP, rossa nel disegno vediamo che è sempre presente) che a quel punto può richiamare RNA POL III. La meccanicistica è sempre molto simile, abbiamo sempre una serie di proteine che devono consentire al meccanismo di prendere luogo, di funzionare. Alcune di queste intervengono subito, riconoscono il DNA e fanno da proteina ponte,

è un po' come un lego. Siccome sono più proteine che devono intervenire, ciascuna funge da incastro per la proteina successiva e soltanto quando questa impalcatura è ben posizionata, arriverà l’enzima che svolgerà la funzione. In questo caso SOLO DOPO che si posiziona TBP arriva l’enzima RNA POL III. PROMOTORI A MONTE Promotore classico, ovvero in questo caso non abbiamo nessun elemento del promotore che continua con la trascrizione ma finiscono a livello del primo nucleotide, il -1 è l’ultimo nucleotide del promotore. Sigle: TATA, Oct, PSE sono sequenze di nucleotidi che richiamano fattori di trascrizioni specifici, si chiamano GENERALI questi che richiamano la proteina TBP e poi si lega l’enzima RNA POL III.

E questo è il PROMOTORE DELLA RNA POL II rispetto a quelli precedenti ci sono tante sequenze dove si vanno a legare tanti fattori di trascrizione differenti. Tantissime proteine che devono complessarsi per consentire poi alla RNA POL II di intervenire. Anche in questo caso però la proteina TBP ha un ruolo fondamentale perché è la proteina che di fatto si va a legare alle sequenze TATA. TATA BOX significa questo ovvero la presenza di queste sequenze TATA che devono essere posizionate però in punti precisi che sono di solito -25 e -30 circa. Le aree funzionali a livello dei quali si può legare l’RNA POL II a livello del suo promotore sono, 3 TIPI DI PROMOTORI POTENZIALI PER L’RNA POL II: -

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SEQUENZA TATA: la sua sequenza e’ altamente conservata (TATAAA); si trova prevalentemente in geni che vengono trascritti rapidamente, e’ localizzata ~25 -30 bp a monte del sito di inizio della trascrizione. ISOLE CPG (citosina fosfato guanina): sono organizzate a formare delle isole, perché possono essere molto lunghe fino a 200 pb e possono essere poste anche un po' lontane al punto di inizio della trascrizione, però la cosa fondamentale è che formano delle regioni concentrate di citosina e guanina che si ripetono a distanze precise e che quindi rappresentano dei siti di riconoscimento importanti. Queste isole CpG sono così importanti perché se nel promotore non c’è la sequenza tata box, le isole CpG diventano la sede a cui si vanno a legare le proteine, che consentono il richiamo di TBP e della polimerasi II. Cioè noi abbiamo 2 TIPI DI PROMOTORE: i PROMOTORI TATA e TATA LESS ovvero promotori privi di TATA ma posseggono le isole CpG, perché comunque a livello di questi promotori devono essere presenti delle regioni che devono essere riconosciute dalla RNA POL. INIZIATORE che però è una regione veramente poco presente come promotore della RNA POL II.

Diciamo che i promotori della RNA POL II contengono o le sequenze TATA BOX oppure le ISOLE CPG. Tutte le altre sequenze che vediamo sono tutte sequenze importanti perché devono richiamare l’azione di questi promotori, di questi fattori di trascrizione, che devono consentire all’RNA POL di potersi posizionare. Alcuni di questi sono anche coinvolti in quei meccanismi di riparo, cioè nel senso che se ci sono dei danni che non stati individuati dai meccanismi di riparo propriamente detti, anche i fattori di trascrizione possono riconoscere le basi sbagliate e in quel caso non sono in grado di correggere ma impediscono alla RNA POL di poter trascrivere e quindi bloccano l’attività dell’enzima.

RIASSUMIAMO: La trascrizione sia negli eucarioti che procarioti si può verificare solo se a monte della regione che deve essere trascritta è presente una regione di regolazione che si chiama PROMOTORE a livello della quale sono presenti una REGIONE CORE che è quella dove ci sono le sequenze che consentono l’interazione con la RNA POL e poi ALTRE REGIONI DEL PROMOTORE che legano proteine che possono essere attivatori o repressori che aiutano il meccanismo della trascrizione ad avvenire oppure no. Abbiamo detto che sia se la trascrizione viene attivata o inibita è comunque un evento che la cellula controlla perché è in quel modo che deve essere prodotto oppure no un determinato RNA. Vi ricordo che l’RNA POL nei PROCARIOTI è 1 che trascrive tutti gli RNA codificanti e non codificanti. Negli EUCARIOTI invece abbiamo 3 RNA POL ciascuna deputata a trascrivere RNA diversi. Il fatto di avere RNA POL diverse a determinato la presenza di promotori che hanno delle organizzazioni funzionali nel loro interno diverse. Quando parliamo di organizzazione funzionali significa che cambia quello che è il sito di legame della RNA pol o delle proteine che intervengono però nello schema generale una regione specifica che lega l’enzima e poi altre regioni di regolazione. La cosa comune che dobbiamo ricordare delle RNA pol è la proteina TBP. RIPRENDIAMO DAL PROMOTORE DELLA RNA POL II Si definisce core (o elemento centrale) del promotore il gruppo minimo di sequenze necessarie per un inizio accurato di trascrizione da parte del macchinario della Pol II. Il core del promotore è lungo in genere circa 40-60 nucleotidi e si estende a monte o a valle del sito d’inizio della trascrizione. La figura mostra la localizzazione degli elementi del core del promotore della Pol II, rispetto al sito di inizio della trascrizione. Questi sono: -

l’elemento riconosciuto da TFIIB (BRE), l’elemento TATA (TATA-box), l’iniziatore (Inr) e gli elementi a valle del promotore (DPE, DCE e MTE).

In genere un promotore contiene solo alcuni di questi elementi. Nella figura sono mostrate le sequenze consenso di ciascun elemento e il fattore generale di trascrizione a esse legato. Oltre all’elemento centrale del promotore (e principalmente a monte di esso), ci sono anche altre sequenze importanti per una trascrizione efficiente in vivo. Questi elementi costituiscono le sequenze regolatrici che sono raggruppate in diverse categorie, a seconda della loro localizzazione, dell’organismo in questione e della loro funzione. Queste sequenze includono: elementi del core del promotore, sequenze attivatrici a monte (UAS, upstream activator sequences), enhancer e una serie di elementi repressori chiamati silenziatori (silencers), elementi di confine (boundary elements) e isolatori (insulators). Tutte queste sequenze di DNA legano delle proteine regolatrici (attivatori e repressori), che aiutano o inibiscono la trascrizione dal core del promotore.

INIZIO DELLA TRASCRIZIONE DELLA RNA POLIMERASI NEGLI EUCARIOTI

Prima si posizionano tutta una serie di proteine nella regione del core promoter, che sono chiamati FATTORI GENERALI DELLA TRASCRIZIONE. Successivamente arriva la RNA pol. Siamo difronte ad un meccanismo a cascata. Punto importante della trascrizione è la fosforilazione della regione CTD che fa parte della struttura dell’enzima. In seguito alla fosforilazione di questi aa l’enzima comincia a trascrivere.

L’inizio della trascrizione da parte dell’RNA Pol II richiede fattori multipli 1.

FATTORI DI TRASCRIZIONE GENERALI (GTF) si chiamano così perché sono proteine che faranno parte dell’apparato basale della trascrizione, si possono quindi chiamare per non fare confusione FATTORI BASALI DELLA TRASCRIZIONE, sono quelli indispensabili perché l’RNA POL II interagisce proprio con questi, gli servono per il suo funzionamento vero. insieme con l’RNA Pol II formano l’apparato trascrizionale basale, sufficiente alla trascrizione in vitro (in assenza di cromatina) tra questi: – TBP (fattore che lega il DNA in modo sito-specifico; con i fattori associati a TBP (TAFs) forma TFIID, TFIIA, TFIIB, TFIIF, TFIIE, TFIIH

Dunque, questi sono quelli che prendono direttamente contatto con la RNA pol II e quindi consentono direttamente è proprio un legame diretto con la proteina RNA pol II altrimenti questa non potrebbe iniziare a trascrivere. Quindi diciamo sono proprio quelli con i quali entra in diretto contatto. Tutte le altre nell’elenco servono per ATTIVARE o REPRIMERE la trascrizione, sono successive. E’ chiaro che sono importanti, perché se il DNA non diventa decompattato e disponibile alle proteine (co-attivatori) non si può verificare la trascrizione, però non sono le proteine che direttamente interagiscono con la RNA POL. 2.

Fattori di trascrizione specifici -richiesti per la trascrizione già attivata - servono per reclutare e assemblare l’apparato trascrizionale, sia direttamente che mediante il reclutamento di co-attivatori. – si legano a elementi di riconoscimento sul promotore e sull’enhancer. – Fattori di trascrizione sono normalmente coinvolti nell’attivazione di un gene.

3.

Co-attivatori, richiesti per la trascrizione in presenza di cromatina (trascrizione attiva) – TAFs – Acetilasi di istoni (HATs) – Proteine che rimodellano la cromatina (SWI/SNF) Il rimodellamento della cromatina porta ad un decompattamento, ad una apertura del DNA, questo favorirà il processo della trascrizione perché il DNA si rende disponibile alle proteine che devono interagire con l’unità di trascrizione; come anche quando gli istoni sono acetilati in cui l’interazione degli istoni con il DNA diminuisce e per cui diventa ancora più disponibile e quindi le proteine si possono posizionare.

4.

Fattori associati all’RNA polimerasi (il Mediatore) vengono considerati degli inibitori per eccellenza però fanno parte sempre della mega famiglia dei fattori di trascrizioni generali.

I FATTORI GENERALI DELLA TRASCRIZIONE (GTF)  assemblaggio del complesso di inizio della trascrizione e PUNTO DI CONTROLLO DI REGOLAZIONE GENICA. I GTFs sono quasi tutti proteine multimeriche Il loro assemblaggio su un core promoter avviene secondo una sequenza precisa Vediamo punto di inizio della trascrizione poi vediamo la regione TATA BOX, in cui si vanno a posizionare le proteine che servono a consentire l’attacco della RNA pol. Succede che si verificano una serie di eventi che portano queste proteine a posizionarsi ad incastro. Per cui ci sono le proteine TBP che creano una distorsione, dopodiché vengono richiamati vari fattori: TFIIA, TFIIB, TFIIF, TFIIE e a mano a mano che si assembrano formano un’impalcatura che consente alla RNA pol di poter funzionare. Non è necessario il primer perché la struttura che formano queste proteine consente comunque di poter posizionare il primo nucleotide.

Determina una distorsione che è fondamentale per il posizionamento delle altre proteine.

TBP comune all’attività biologica di tutte le polimerasi, anche se ciascuna di queste ha un promotore diverso e trascrivere per RNA differenti.

Quando tutte le proteine si sono posizionate il complesso di PRE-INIZIO risulta STABILE. L’INIZIO vero è proprio è quello in cui viene trascritto il primo nucleotide, però prima di essere trascritto questo primo nucleotide, ci sono queste fasi che devono posizionare tutte queste proteine nella regione del promotore. Quindi quando tutte queste proteine si sono posizionate, quello che era il complesso di pre-inizio, si è formato, ed è

stabile (è importante che lo sia in quanto affinché una determinata attività venga svolta è che quelle proteine che sono in contatto devo rimanere così per un arco di tempo che è quello necessario per l’attività biologica che devono compiere). Questa impalcatura che si è formata è molto stabile ma anche veloce perché così come si è formata, deve liberare RNA pol, perché senò rimane bloccata. Quindi tutte queste proteine consentono alla RNA pol di iniziare e dopodichè l’RNA POL viene lasciata andare. I FATTORI DI TRASCRIZIONE TFIIE e TFIIH Essi sono importanti perché posseggono anche attività elicasi e intervengono direttamente nella formazione della struttura, conformazione attiva della RNA POL. Coinvolti anche nel meccanismo della fosforilazione del CTD. Dunque: -

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