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Relatório que analisava a quantidade de microrganismos presentes nas mãos dos alunos ...

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Instituto de Ciências Ambientais, Químicas e Farmacêuticas Universidade Federal de São Paulo Graduação em Ciências Ambientais

Ayrton Silva Ferreira Gabriel Beltran Prado Ricardo do Carmo Herrero Suellen Silva Vieira Cruz Vitor de Oliveira Zaize

Relatório de Aula Prática II

Prof. Dra.   Suzan   Pantaroto   de   Vasconcellos  Prof. Dr.   Wagner   L.   Baptista 

Diadema 2017

1.Introdução

Nos estudos de crescimento de microrganismos em laboratório existem alguns meios de cultura que podem ser classificados de várias formas: sólido, semissólido ou líquido, os dois mais utilizados são: líquido geralmente usados em tubos de ensaio e o sólido, que são usados em placas Petri. (KONEMAN, E.W. et al, 2008). Quando é necessário usar o sólido, utiliza-se agentes solidificantes é preferencialmente escolhido o ágar, pois não serve como nutriente para a maioria dos microrganismos e não é metabolizado durante o processo, diminuindo as chances do experimento não ocorrer como esperado. Esse processo de crescimento ocorre pois a composição

dos

meios de cultura atende as necessidades nutricionais do

microrganismo que se pretende replicar (VASCONCELLOS, BATISTA, 2017) como realizado na atividade em aula prática . As técnicas de controle de microrganismos são necessárias para delimitar o crescimento microbiano, essas técnicas consistem em dois meios: físicos utilizando principalmente o calor e químicos fazendo uso de reagentes, geralmente o mais usado é o físico por questões de eficácia, praticidade e custo, o principal dispositivo usado em laboratórios e que foi o meio que realizamos o procedimento, utilizando uma Autoclave. O isolamento bacteriano consiste em primeiramente a inoculação da amostra do estudo que é necessário para realizar a diluição seriada, feita quando a amostra é de origem desconhecida ou quando não é possível saber o número de microrganismos que podem-se encontrar (VASCONCELLOS, BATISTA, 2017), foi necessário esse procedimento para amostra coletada no experimento. Para que seja analisada a cultura e fazer a contagem de colônias bacterianas é necessário fazer o plaqueamento em superfície, tornando assim possível a visualização a olho nu de cada colônia.

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2. Objetivos ● Familiarizar-se com as técnicas para preparo de meios de cultivo e isolamento de microorganismos; ● Evidenciar ação de agentes antissépticos sobre controle microbiano; ● Demonstrar as técnicas de assepsia e outros procedimentos necessários às atividades de isolamento.

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3. Materiais e Métodos 3.1. Experimento 1 - Parte A - Preparo dos meios de cultura. 3.1.1. Materiais ● Erlenmeyer; ● Bagueta; ● Autoclave; ● Tampão de algodão com gaze; Para o preparo dos meios de cultura foram utilizados: ● 0,15 g de extrato de carne; ● 0,5 g de peptona; ● 0,25 g de Cloreto de Sódio (NaCl); ● 1,0 g de ágar; ● 50 mL de água Destilada.

3.1.2. Métodos Após a pesagem dos ingredientes necessários para o preparo dos meios de cultura, os mesmos foram adicionados à um erlenmeyer, adicionando a água destilada aos poucos, agitando o frasco vagarosamente e dissolvendo os ingredientes sólidos com o auxílio de uma bagueta. Após a preparação da mistura, o frasco de erlenmeyer foi tampado e enviado para a esterilização na autoclave.

3.2. Experimento 1 - Parte B - Preparo das placas de Petri e tubos de

ensaio para inoculação.

3.2.1. Materiais ● Álcool 70 % ; ● Lamparina; ● Placa de Petri estéril; ● Pipeta de Pasteur; ● Meio de cultura da atividade anterior (A). Diadema 2017

3.2.2. Métodos Próximo à lamparina (evitando o risco de contaminação), foram dispensados 20 mL do meio de cultura líquido nas placas de Petri. Após este procedimento, as placas foram devidamente identificadas e reservadas para a solidificação do meio.

3.3. Experimento 1 - Parte C - Efeito da ação de antissépticos sobre o crescimento.

3.3.1. Materiais ● Placas de Petri com meios de cultura prontos; ● Caneta; ● Água; ● Sabão; ● Álcool 70%;  3.3.2. Métodos Afim de se verificar a efetividade da ação de antissépticos no controle microbiano foram necessários 3 alunos, cada qual deveria lavar as mãos utilizando-se de métodos anti sépticos distintos: o primeiro aluno deveria lavar suas mãos apenas com água; o segundo lavaria suas mãos com água e sabão; já o terceiro utilizaria água, sabão e álcool 70%. Haveria um quarto aluno que não lavaria as mãos e as passaria por diversas superfícies e objetos do laboratório, como mochilas, calçados e bancadas. Após a espera da secagem ao ar livre das mãos, os quatro alunos pressionaram seus dedos em suas Placas de Petri respectivas a fim de comparar tais procedimentos. Após o processo anterior, as quatro placas foram incubadas em uma estufa para a desenvolvimento da colônia.

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3.4. Experimento 1 - Parte D - Isolamento e obtenção de cultura pura. 3.4.1. Inoculação de amostras de solo 3.4.1.1. Materiais ● 1 grama de solo recolhido do campus; ● Lamparina; ● Erlenmeyer; ● Água destilada estéril; ● Tubos de ensaio; ● Pipeta de Pasteur;

3.4.1.2. Métodos Após a pesagem da amostra de solo, a mesma foi transferida para um frasco erlenmeyer contendo 100 mL de água destilada estéril próximo à lamparina. Em seguida, o frasco foi devidamente tampado e agitado por alguns minutos. Com uma pipeta, foi retirada uma alíquota de 1mL da solução água-solo e adicionada à um tubo de ensaio contendo 9 mL de água destilada, agitando o tubo após o processo. Com o auxílio de uma pipeta, foi retirada uma alíquota de 0,1 mL da solução do tubo anterior e transferida para um tubo de ensaio contendo 9 mL de água destilada. Novamente, com uma pipeta, foi retirada uma alíquota de 0,1 mL do tubo de ensaio anterior e transferida para um terceiro tubo contendo 9 mL de água destilada. Após o terceiro processo de diluição, foi retirado com uma pipeta 0,1 mL do primeiro tubo e transferido para uma placa de Petri, repetindo este processo com os outros dois tubos diluídos. Com as três placas prontas e devidamente identificadas, as mesmas foram incubadas em uma estufa a fim de esperar o crescimento das colônias.

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3.4.2. Isolamento por estrias

3.4.2.1. Materiais ● Lamparina; ● Haste descartável;

● Placa de Petri contendo uma cultura bacteriana.

3.4.2.2. Métodos Próximo à lamparina, foi aberta a placa de Petri contendo a cultura bacteriana e com a haste descartável foi retirada uma alíquota da cultura e transferida para as placas de Petri montadas no procedimento B, realizando-se as estrias de esgotamento. Após o processo de estriagem, as placas foram incubadas em estufa para esperar o crescimento da cultura.

4. Resultados e discussões. Após o processo de esterilização pelo vapor saturado sob pressão realizado em autoclave do experimento 1 parte A, tendo como resultado esperado, a destruição dos microrganismos pela ação combinada de tempo, temperatura, pressão e umidade promovendo a termocoagulação e desnaturação das proteínas de sua estrutura genética celular, foi observado no experimento 1 parte B, a solidificação da cultura da mistura líquida nas placas de Petri. Este processo de esterilização é realizado em odonto-médico-hospitalares, pois é uma importante medida de controle de infecções associados aos cuidados em saúde. No experimento 1 parte C, após coletado as amostras das palmas das mãos dos quatro alunos, foram colocados na estufa as placas de Petri contendo as amostras por um período de uma semana e após isso, foi observado no meio de cultura da placa de Petri do aluno que lavou as mãos apenas com água (placa A) desenvolvimento de colônias de bactérias maior do que o aluno que lavou as mãos com água e sabão (placa B) podemos ver a comparação nas imagens 1 e 2, o aluno que utilizou água, Diadema 2017

sabão e álcool 70% (placa C),

e o aluno que não lavou as mãos e as sujou em

diversas superfícies do laboratório, mochila, calçados e bancadas (placa D).

Foi

observado menor formação de colônias de bactérias na placa de Petri C do aluno que utilizou água, sabão e álcool 70% como podemos observar nas imagens 3 e 4.

Imagem 1: Placa A - Fonte: Autor.

Imagem 2: Placa B - Fonte: Autor.

Imagem 3: Placa C - Fonte: Autor.

Imagem 4: Placa D - Fonte: Autor.

No experimento 1 parte D, foi observado, após as placas de Petri com amostras de solo serem retiradas da estufa, a formação de colônias bacterianas, porém somente na placa -5 dá pra ser feita a contagem de colônias como é possível ver na imagem 5, na placa -3 foi localizado apenas três colônias de bactérias como demonstrado na imagem 6.

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Imagem 5: Placa -5 (amostra de solo)

Imagem 6: Placa - 3 (amostra de solo)

Fonte: Autor.

Fonte: Autor

No experimento de isolamento por estrias, após retiradas as placas de Petri da estufa depois de uma semanal foi observado o crescimento das colônias de bactérias conforme o esperado, mostrado nas imagens 7 e 8.

Imagem 7: Colônias duplicadas

Imagem 8: Colônias duplicadas

Fonte: Autor.

 Fonte: Autor.

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5. Conclusão Com base nos resultados obtidos pode-se concluir que a autoclavagem é um método de esterilização eficaz, pois o resultado foi obtido como esperado as placas foram feitas corretamentes, apesar que o tempo em excesso na estufa causou alguns danos. No experimento 1 parte C o resultado foi quase o esperado (quanto menor é a higiene, maior é a quantidade de micro-organismos), a placa D, que é a placa das mãos sujas, foi populada por menos colônias do que a placa A, que é a placa das mãos lavadas apenas com água, devido a higiene prévia do aluno com água, sabão e álcool 70%, além disso a umidade pode ter sido decisiva para um desenvolvimento maior de colônias, pois não houve esterilização com sabão, apenas com água. O isolamento das culturas presentes no solo do campus Diadema da Universidade Federal de São Paulo, unidade de pesquisa José de Alencar teve êxito e a observação das culturas foi possível.

Bibliografia: 1. KONEMAN, E.W. et al. Diagnóstico Microbiológico: Texto e Atlas. 6ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2008. 2. MADIGAN M. T. et al. Microbiologia de Brock.14.ed. Porto Alegre: Artmed, 2016. 1032p. 3. VASCONCELLOS. S.P e BATISTA.W.L. Laboratório 2: Roteiro de orientação ao laboratório, São Paulo, 2017, 08p. 4. Ferreira Veiga Tipple, Anaclara, Vieira Pires, Francine, Vieira Toledo Guadagnin, Simone, de Sousa Melo, Dulcelene, O monitoramento de processos físicos de esterilização em hospitais do interior do estado de Goiás. Revista da Escola de Enfermagem da USP 2011, 45: [Consulta em: 2 de diciembre de 2017] Disponivel em: ISSN.

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