Replikation - Zusammenfassung Mikrobiologie PDF

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DNA Zusammenfassung...

Description

Replikation Identische Verdopplung der DNA

Die Struktur der DNA ist die Grundlage für die Vervielfältigung und Vererbung     

Eigenschaften der DNA sind essentiell: Aufschmelzen, Basenpaarung) Die DNA Replikation ist semikonservativ DNA-Polymerasen benötigen eine Vorlage (Matrize), einen Primer, eine freies 3’OH-Ende Die Replikation erfolgt bidirektional Die DNA-Synthese erfolgt in 5‘-3‘-Richtung

Die Eigenschaften der DNA sind eine wesentliche Voraussetzung der Replikation 1. DNA-Doppelhelix 2. Korrekte Basenpaarung über H-Brücken 3. Reversibles Schmelzen (das Schmelzen der DNA kann verfolgt werden)

Die DNA Replikation erfolgt semikonservativ  jeder Strang kann durch Komplementarität als Matrize dienenn  Es entstehen zwei identische Replikate, die einen Eltern- und einen Tochterstrang haben  Getrennte Elternstränge dienen als Matrize für Synthese von zwei Tochersträngen

Die Replikation ist gerichtet (von 5‘ nach 3‘) und benötigt ein freies 3‘-OH-Ende 

Nucleophiler Angriff der 3‘-OH-Gruppe

Die 3 Schritte der DNAReplikation 1. Beginn: „Aufschmelzen“ der DNA 2. Synthese des neuen Strangs komplementär zum Elternstrang (5‘ – 3‘) 3. Abschluss der Replikation

DNA-Replikation: Aufwinden der DNA unter ATPVerbrauch mit Hilfe der Helikase  Helikase hebelt Doppelstrang auf  Helikase kann als ATP-bindendes und –spaltendes Enzym die bei der ATP-Hydrolyse frei werdende Energie in mechanische Arbeit umwandeln  ATP-getriebene Helikase wandert entlang Doppelhelix und trennt komplementären Stränge  SSB-Proteine stabilisieren entwundene Stränge

Die DNA Replikation ist bidirektional = verläuft von einem Startpunkt aus in beide Richtungen

Beginn der Replikation: Synthese eines RNA-Primers    

Primer: Vorreiterrolle Synthetisieren kurzes Stück komplementärerer RNA von 3-10 Ribonucleotiden An freies 3‘-OH-Ende des Primers kann DNA-Polymerase III weitere Nukleotide anfügen RNA-Primer wird zum späteren Zeitpunkt der Replikation wieder entfernt

Verknüpfung der DNA im Folgestrang: Die DNA-Ligase    

Enzym Verknüpft zwei nicht verbundene Nukleotide eines DNA-Strangs durch eine Esterbindung Verwendung von NAD+ oder ATP Voraussetzungen: intake 5‘-Phosphat-Gruppe, 3‘-OH-Gruppe

Enzyme der DNA-Replikation    

Start: Helikase – Aufwinden der Stränge Bereitstellung eines Primers (Primase [DNA Polymerase α]): RNA-Primer DNA-Polymerasen: α, δ: DNA-Synthese ,ε: Synthese, Reparatur, β-Reparatur Abschluss: Exonukleasen entfernen RNA-Primer, DNA-Polymerase zum Auffüllen der Lücke, DNALigase zum Verbinden der Stücke

Die Replikationsmaschinerie    

Assemblierung (verbinden) und Fixierung der DNA Polymerase mit Hilfe von PCNA und RFC PCNA: Proliferating-Cell-Nuclear-Aging Verdrängen Polymerase α RFC-Proteine: Replikationsfaktor C Polymerase α kann so durch Polymerase δ ersetzt werden

Die DNA Polymerase benötigt Helferproteine, um an die DNA zu kommen  

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PCNA, ein Kofaktor der DNA-Polymerase δ, lokalisiert im Zellkern PCNA (Sliding clamp) o hält DNA-Polymerase an der DNA o ermöglicht schnelle Synthese am Vorwärts- und Rückwärtsstrang o bindet ständig an die Replikationsgabel Clamp-loading Maschinerie: bringt PCNA zur DNA, ATPase

Die Replikationsgabel   

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Beide Tochterstränge werden in 5‘-3‘-Richtung synthetisiert Leit- und Vorwärtsstrang wird kontinuierlich am 3‘-5‘-Matrizenstrang hinter Replikationsgabel synthetisiert Rückwärts- und Folgestrang umgekehrte Orientierung: Syntheserichtung weg von Replikationsgabel

Okazaki-Fragmente: bei Replikation entstehen kurze Abschnitte des Folgestrangs aus DNA und RNA Bis zu 1.000 Nukleotide lang

Posaunenmodell der Replikationsgabel Die DNA-Polymerase funktioniert als Dimer  

Schlaufenbildung des Matrizenstrangs bewirkt, dass der Matrizenstrang in die Polymerase einfädelt und damit ermöglicht in 3‘-5‘-Richtung den Matrizenstrang abzugreifen Gleichzeitig bewegt sich Polymerase aber zur Gabel hin

Funktion der DNA-Polymerase

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DNA-Polymerisation am 3‘-Ende Korrekturlesefunktion am 3‘-Ende P: Polymerase-Aktivität E: Exonukleasen-Aktivität Der Einbau einer nicht-komplementären Base führt zu einem Stillstand der Polymerase Reaktion

Die Chromosomenenden

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Problematik bei der Replikation linearer DNA: Mit Entfernung des 5‘-terminalen Primers verbleibt inkompletter Tochterstrang, der von DNA-Polymerasen nicht aufgefüllt werden kann Der unvollständige Tochterstrang wird mit Hilfe der Telomerase verlängert

Mechanismus der Telomerase  Telomerase o Katalytische Untereinheit mit reverser Transkriptase-Aktivität (hTERT) o Telomerase-RNA (hTR) im aktiven Zentrum o RNA-Sequenz: 3‘-CCCCAA-5‘  Die RNA der Telomerase dient als „Template“ für die Verlängerung des Matrizenstrangs  Telomerase dockt an 3‘-Ende des Matrizenstrangs an  DNA-Polymeraseaktivität der Telomerase nutzt RNA-Sequenz als Matrize, um diesen an den 3‘-Terminus zu hängen  Die Primase kann komplementär zum verlängerten Matrizenstrang einen RNA-Primer synthetisieren, der dann durch die DNA-Polymerase verlängert wird  Menschliche Telomersequenz: TTAGGG

Aktivität der Telomerase variiert  

Zellalterung: niedrige Aktivität Tumorwachstum: geringe Aktivität, unkontrollierte Zellteilung

Telomerase und Tumor   

Telomerase ist verantwortlich für ständige Zellproliferation Ist in den meisten somatischen Zellen nicht aktiv außer in sich teilenden Vorläuferzellen du in aktivierten Lymphozyten sowie in ~58% aller menschlichen TUmorengewebe Angriffspunkt für Tumotherapie (Enzym oder RNA als Zielstruktur)

Zusammenfassung 

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Telomere o Repetetive DNA an Chromosomenenden (TTAGGG/AATCCC beim Menschen) o Bei der Geburt: 15 bis 20.000 Basenpaare o Schützt Chromosomen vor Abbau und dem Verlust von Genen o Sind spezielle Chromatinstrukturen an Chromosomenenden, die verhindern, dass die Enden als Strangbrüche erkannt werden o Werden ständig verkürzt, in meisten menschlichen Zellen mit zunehmendem Alter Telomerase o Erhält die Telomerlänge o Ist vorhanden in embryonalen Zellen und proliferativen Zellen o In regenerierendem Gewebe, nicht in somatischen Zellen o Erkennt das 3‘-Ende eines Chromosoms o Hängt neue Telomer-Repeats an das Chromsomenende (de novo) o Nutzt ein assoziierte RNA-Molekül als Template (ist eine zelluläre Transkriptase)

Telomerase – menschliche Erkrankungen    

Patienten mit atherosklerotischen Herzerkrankungen: kürzere Telomere als altersgleiche Personen Dyskeratosis congenita (DKC): Knochenmarkserkrankung Viele Tumore: Expression von Telomerase (Entwicklung von Telomerase-Inhibitoren) Telomerase-Aktivität in Stammzellen: Stammzellen mit Bedeutung für die Geweberegeneration

Start der DNA-Replikation  

~30.000 Replikationsursprünge (Origins) pro Zelle Origin: keine definierte Sequenz, AT-reiche Region

Replikationsursprung    

Mehrere Replikationsursprünge pro Chromosom Abstand zwischen den Replikationsursprüngen: 30 bis 100kb Replikationsursprünge sind zu unterschiedlichen Zeiten aktiv Binden den ORC (Origin recognition complex: ~6 verschiedene Proteine)

Aufbau des DNA Replikationskomlexes am Replikationsursprung: einmalig im Zellzyklus   

ORC und MCM-Proteine (dienen als Helikasen) markieren Startpunkte der Replikation Proteine werden später wieder entfernt ORC bindet an Origin und rekrutiert Faktoren, worauf MCM-Helikasen binden, die die DNA aufschmelzen

ORC Komplex Komponenten als Ursache von Erkrankungen      

Meier-Gorlin-Syndrom ORC 1, 4 , 6 betroffen Selten Autosomal rezessiv Intrauterines und postnatales Wachstum verzögert Mikrozephale (Außenohrwachstum beeinträchtig), Knochendysplasie)

MCM Proteine funktionieren als Helikasen    

MCM wird inaktiv auf DNA geladen (Doppel-Hexamer) Aktivierung der MCM-Helikase  Öffnung der DNA RLC (replication licensing system) ermöglicht MCM Komplex den Zutritt zu Replikationsorigins in der G1-Phase MCM-Komplex wird durch die Replikationsgabel von replizierender DNA verdrängt

Topoisomerasen entwinden DNA-Stränge Nukleosomen bei der Replikation     

Verteilung der Histonstränge auf Filialstränge 50% der Nucleosomplätze bleiben erst unbesetzt CAF-1 arbeitet hinter Replikationsgabek her und komplementiert Verpackung der Filialstränge auf neu synthetisierte Histon-Stränge Diassembilierung Wiederaufbau...